誰限制了長RNA出核？
細胞區室化（compartment）是真核細胞的核心特徵，核膜將細胞分為細胞核和細胞質，是細胞最大的2個區室。細胞內的很多生物大分子並不是均勻分布在核膜兩側。例如，人們現在已經熟知，作為mRNA的前體，pre-mRNA必須經過帶帽，剪接，加尾等加工（processing）之後才能從核孔複合體（NPC）中離開。很多長非編碼RNA（lncRNA）也體現出明顯的核質分布不均勻，這一類依賴於序列特徵（長/非編碼）而統一命名的RNA，功能各異，近幾年備受關注。
作者對長RNA在細胞核中滯留的分子機制進行了研究。他們的前提假設是：一些短序列能夠作為cis-element，至少是一些lncRNA和mRNA在細胞核中富集的原因。
篩選目標序列
研究者構建了一個報告系統，由兩部分核心組成：
1.選取37個人lncRNA，13個小鼠核富集mRNA的3"UTR，以及MALAT1（核富集突出的lncRNA ）的4個同源基因（小鼠，斑馬魚，棘魚（Stickleback），蜥蜴（Lizard）），共計54個基因，構建了5511 條（tile）以109 nt為步長平均重疊25 nt的短序列文庫；
2.將短序列文庫克隆到報告基因AcGFP mRNA的5"和/或3"UTR區域，稱為文庫NucLibA，轉染到MCF7細胞中（3次重複）後核質分離，分別對全細胞抽提物（WCE），細胞核（Nuc），細胞質（Cyt）組分、以及input質粒文庫進行測序（每個樣本的測序量＞10 M reads）。
根據測序數據，計算每條tile的核質分布比（Nuc/Cyt Ratio）。
研究者從中篩出來自14個基因的19個區域，這些區域均跨越2-4條tile，並且每條tile都有＞30%的核富集。來自lncRNAJPX，PVT1，NR2F1-AS1的區域表現出最高的核富集度，並且在GFP的5"和3"-UTR具有相似的強度。這3個區域的tile序列與反向的Alu重複序列重疊。
作者從tile覆瓦重疊之間發現一個長度為42 nt，含有3段至少6個嘧啶（C/T）串的有效序列，其中兩段序列相似，符合R(A/G)CCTCCC的保守序列，作者將這段42 nt序列起名為SIRLOIN（SINE-derived nuclearRNALocalizatIoN）（沙朗牛排）。
驗證序列功能
作者選取獨立的SIRLOIN序列，通過核質分離RT-PCR和PrimeFlow RNA assay進行的細胞流式均表明，含有SIRLOIN的序列可以驅動GFP mRNA待在細胞核中。
從GENCODE v7中的MCF7細胞核質分離RNA-seq數據中，作者發現，整體來看SIRLOIN元件與核RNA相關。從GENCODE細胞數據中發現，10個細胞株中的9個也同樣表現出含有2個及以上SIROIN元件的RNA表現出顯著的核富集。並且，RNA內部外顯子中的SIRLOIN具有更強的核富集。有趣的是，如果含有SIRLOIN的外顯子可以發生可變剪接，能夠保留SIRLION的轉錄本在細胞核中含量更高（平均1.07-1.53倍，7/10株細胞中P＜0.05）。
有了以上結果後，研究者構建了另一個文庫（NucLibB），包括了更多含有 SIRLOIN元件的lncRNA和mRNA相關區域的覆瓦tile，以及對JPX#9和PVT1#22中兩段30 nt片段（NucLibA中最有效）各種序列的突變。從中又得到來自5條lncRNA和5條mRNA的18個SIRLOIN重疊區域。
對來自JPX#9和PVT1#22的SIRLOIN的序列突變發現，維持其雙核苷酸組成的序列重排並不影響這些序列對RNA核富集的作用。增加SIRLOIN核心重複序列拷貝數可以增強核定位能力。
SIRLOIN序列中第2段RCCTCCC中，嘧啶向嘌呤（A/G）的點突變即可破壞SIRLOIN元件的作用，但是在RCCTCCC區域之外的A-T和G-C突變也會影響其功能。
誰識別/結合SIRLOIN？
作者從ENCODE eCLIP數據中尋有SIRLOIN序列富集的RNA-蛋白直接相互作用位點。在分析得到的112個蛋白中，hnRNPK排名第一。hnRNPK的結合位點遍布整個轉錄組，CCTCC是其結合峰中的核心序列。這與SIRLOIN中的RCCTCCC序列吻合。
RIP實驗表明hnRNPK能夠結合帶有SIRLOIN AcGFP mRNA，而對失去有效核定位能力的SIRLOIN單點突變的AcGFP mRNA的結合能力明顯下降。使用λN peptide-BoxB系統將hnRNPK錨定到Luciferase mRNA的3"UTR，足以誘導~3倍的細胞核富集。
重要的是，在HepG2細胞中，hnRNPK的eCLIP數據表現出binding cluster和該RNA核富集之間的相關性（R=0.14，P＜10-16）。在K562細胞中，這一現象相比較弱（R=0.05，P=3.6×10-7）。相比之下，另一個RNA結合蛋白PCBP2的eCLIP binding cluster數目與該RNA核質分布無關。
值得注意的重要現象是，在HepG2細胞中，對於那些不含有任何SIRLOIN元件的RNA，hnRNPK的eCLIP binding cluster數目與該RNA的核富集程度之間的關係（R=0.15）與上文提到的整體RNA的核富集程度幾乎相同（R=0.14）。
在MCF7細胞中，siRNA KD hnRNPK後，大量基因的核質分布發生變化，其中，397基因發生2倍以上的核富集，而283基因變得在細胞質中更多。其中，核富集程度的降低與hnRNPK eCLIP cluster數目之間存在顯著相關性（R=-0.22）。關鍵的是，在hnRNPK KD後，帶有1個以上SIRLOIN元件基因的核富集顯著降低。
有趣的是，在hnRNPK KD後，帶有hnRNPK eCLIP位點的靶基因發生平均~4%的表達下調，並且中細胞核中平均下調21%，細胞質中卻平均上調10%。
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hnRNPK識別位點 or SIRLOIN元件 ?
總結下來，這項研究試圖尋找能夠驅動長鏈RNA核富集的短序列元件，找到了帶有RCCTCCC共有序列的SIRLOIN元件，發現該元件能夠驅動報告基因核富集，通過序列突變分析，證明RCCTCCC序列對SIRLOIN的重要性。通過分析eCLIP數據，發現核定位RNA結合蛋白hnRNPK的結合序列與RCCTCCC重疊。
hnRNPK是一個大量表達、高度聚集在細胞核中的RNA結合蛋白。本文尋找到的SIRLOIN元件包括hnRNPK的結合位點，但是hnRNPK的結合位點並不僅限於SIRLOIN元件，因此SIRLOIN元件至多是hnRNPK結合的必要不充分條件。也就是說，沒有SIRLOIN元件的RNA也可以被hnRNPK結合。本文並未統計hnRNPK的eCLIP位點中，SIRLOIN元件佔有的比例。
換句話說，本研究的故事還可能是：hnRNPK通過與含有其結合位點的RNA直接結合，將這些RNA滯留在細胞核中，由於SIRLOIN元件帶有hnRNPK的結合位點，因此是整個機制中的一個子集？
很容易想到的是，具有核質差異定位的RNA結合蛋白還有很多，其他蛋白是否也可以通過此機制，將所結合的RNA滯留在細胞核中？在某種細胞/背景下，不同核定位RNA結合蛋白對核滯留RNA的定位相對貢獻如何？hnRNPK是主導性因素么？
誠如本文所提倡的，如何採用高通量的方法全面的研究此事？另一方面，RNA出核是一個多因子參與、多步驟的受調控過程。核定位RNA結合蛋白的「挽留」，與RNA出核通路的調控之間有什麼樣的相互關聯？
技術點：核質分離
RNA的核質分布比是全文的重點，高通量的RNA核質比測定幾乎只能依賴於RNA-seq，所以核質分離是唯一的技術手段。
核質分離有多種方法實現，這項研究使用的是基於去垢劑（140 mM NaCl，0.5% NP-40）的核質分離：等滲裂解獲得的上清經高速離心後即為細胞質組分；細胞核沉澱經過同樣buffer washing後，經過250 mM/880 mM sucrose cushion低速分離，沉澱即為細胞核組分。
相比於傳統使用Dounce homogenizer，依賴於去垢劑的方法不需要特殊設備，操作簡單。但是分離效果受去垢劑種類和操作的極大影響。
技術點：UMI（unique molecule index）
本研究在測定報告基因AcGFP的核質分布比時，使用帶有illumina接頭、UMI的基因特異性引物進行反轉錄，從而引入UMI計數。
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