通過體內遞送基因組編輯劑來治療常染色體顯性遺傳性聽力喪失
前言：
2017年12月20日，來自美國哈佛大學broad研究所的華裔教授David Liu和麻省總醫院的Zhenyi Chen教授共同在NATURE發表了題為「Treatment of autosomal dominant hearing loss by in vivo delivery of genome editing agents」的文章，譯即「利用cas9基因編輯技術治療小鼠遺傳性耳聾疾病」。值得一提的是David在這篇文獻使用的基因編輯工具就是之前鼎鼎大名的基於CRISPR-Cas基因編輯系統的單鹼基編輯技術（見備註），在上科大的同學可能大多拜讀過他若干年前發表的關於單鹼基編輯技術的文章。由於該研究的重要意義和巨大前景，Nature 同期發表了題為：An ode to gene editsthat prevent deafness的評論文章，對該研究做了高度評價。
文章導讀：
關於遺傳學耳聾，目前大約有100個耳聾相關的等位基因已被確認，但是很少有治療方法可以減緩或逆轉遺傳性耳聾。基於Cas9的基因組編輯劑可以介導靶向基因的破壞或修復。通過在體內遞送不可複製的瞬時Cas9單引導RNA（sgRNA）核糖核苷酸蛋白（RNP）複合物可提高DNA特異性，並可能提高安全性。與遺傳性耳聾相關的大約20％的等位基因是顯性遺傳。由於Cas9-sgRNA複合物可以通過末端連接過程有效地破壞基因，作者試圖設計Cas9-sgRNA複合物，選擇性破壞與聽力喪失相關的主要等位基因。
作者選擇的靶向基因是TMC1基因，他是哺乳動物毛細胞機械轉導通道的重要組成部分。 TMC1突變與人類隱性和顯性遺傳性耳聾有關，TMC1（T1253A 貝多芬突變）中顯性陰性錯義突變引起毛細胞中單通道電流水平和鈣通透性降低以及人類進行性語言後感覺神經性聽力損失。
縱觀文獻，我認為這篇文獻的作者的實驗思路如下所述
1、設計靶向相關耳聾突變等位基因的sgRNA位點
2、體內外檢測sgRNA對突變等位基因和野生型等位基因的選擇性
3、選擇合適的運輸sgRNA的脂質體
4、鑒定sgrna的脫靶性，挑選最合適的sgrna轉染方式
5、評估cas9-sgrna複合物在體內靶向突變基因的能力，以及相關細胞是否因此受益
6、檢測cas9-sgrna複合物對小鼠聽覺恢復的能力（包括行為學等）
7、 利用高通量測序坐實sgrna確實破壞了相關突變致病基因
文章指出，實驗最終結果表明，cas9基因治療劑（Cas9-Tmc1-mut3-脂質體）注射在Tmc1Bth / +小鼠（Tmc1突變耳聾）中促進毛細胞（耳蝸中負責聽覺的細胞）生長。
作為聽力搶救的行為指標，筆者在注射後8周評估聽覺驚嚇反應。在未治療的Tmc1Bth / +小鼠中，在120dB的刺激後未檢測到驚嚇反應。相比之下，在110和120dB刺激後接受治療的Tmc1Bth / +小鼠中檢測到明顯的驚嚇反應（文獻中圖3d和擴展數據圖4e），證明了治療後聽力保存也保留聲學行為反射。
評析：
縱觀全文，我覺得這篇文獻有幾個值得學習之處，為我們從事生物實驗和書寫科研文章提供了一個可靠的借鑒。
1、首先就是有一個可操作的明確的科研目的，目的就是利用cas9基因編輯技術靶向致病突變基因治療遺傳性疾病，所有實驗手段都是圍繞這一目的反覆證明cas9治療的可行性。
2、思路清晰，環環相扣，從基因組層面，體外體內，靶向細胞與組織層面，動物行為學層面，層層遞進，證明了基因組治療對於遺傳性疾病的可行性。
3、考慮周全，control設置巧妙，為了考慮突變體sgrna僅僅改變一個核苷酸是否真的能特異性針對突變等位基因而不針對只有一個核苷酸不同的野生型基因，筆者不單單只研究了突變sgrna的特異性，還設置了針對野生型sgrna的反向對照，並在體內體外做了兩組實驗，完備的證明了特異性。同時為了證明cas9 sgrna 脂質體的不可替代性，也分別設置了缺損某一要素的對照，也證明該基因療法三大要素是療法可行的充分必要條件。
4、最後一點是相關crispr-cas9在基因治療的，為了避免cas9的長時作用隨機切割破壞細胞基因組，相比質粒轉染時，筆者採用了rnp技術，RNP是非遺傳編碼，預先組裝和短壽命的Cas9核糖核蛋白（RNP）複合物，它的作用時間較短更為安全，也許值得借鑒。
備註：單鹼基編輯技術是基於CRISPR-Cas基因編輯系統開發出來的一種有用的單個鹼基替換手段。其主要是通過將失去酶活性的dCas9蛋白與脫氨基酶比如APOBEC1或者AID融合而成，因此，既具有了dCas9結合特定DNA序列的定位能力，又具有改變鹼基的能力。
參考文獻：
Gao X, Tao Y, Lamas V, et al. Treatment of autosomal dominant hearing loss by in vivo delivery of genome editing agents[J]. Nature, 2017:217-221.
本文作者：汪翰林，男，上海藥物研究所&上海科技大學2017級聯合培養研究生，導師：李佳（研究方向：代謝性疾病創新藥物候選物發現、作用機制及評價研究；基於酶分子家族的創新藥物候選物發現研究；結合小分子探針的細胞識別和細胞命運調控研究。）
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