一顆番茄的成長日記

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一顆番茄果實在成長和成熟過程中，從內而外發生了怎樣的變化？是哪些基因造就了番茄果實的質地、顏色、口感、風味呢？讓我們從分子生物學的視角來看看一顆番茄的成長日記。

番茄是深受人們喜愛的蔬菜，也可以說是水果。

不知道有多少人跟小編一樣，學會的第一道炒菜是番茄炒蛋，學會的第一道涼拌菜是糖拌西紅柿。

小編在挑選番茄的時候，會選擇顏色紅紅的，捏起來有點軟，拿在手上沉甸甸的，這樣的番茄才熟透了，吃起來酸酸甜甜，有一種特殊的清香味。常識告訴我們，番茄果實在生長過程中，顏色由綠變紅，質地從硬變軟，味道從酸澀變甘甜。

那麼從分子生物學的角度來看，番茄在發育和成熟過程中，是哪些基因發揮了作用？番茄的內部組織，發生了怎樣的變化？番茄成熟過程中，又是哪些基因造就了番茄的獨特香味呢？

今天，我們來為大家分享一篇發表於Nature Communication的文章 High-resolution spatiotemporal transcriptome mapping of tomato fruit development and ripening，本文利用激光微解剖(LM)和手工解剖結合RNA-Seq分析，呈現出一個高解析度的番茄水果轉錄組圖譜，為果實的發育和成熟提供了新的分子見解。作者闡明了這些數據可以用來研究肉質水果生物學的各個方面，並舉例說明了一些商業上重要的性狀，如質地、風味、香氣、顏色和代謝成分，以及與轉錄、激素和表觀遺傳調節機制有關的問題。

作者闡明了轉錄組數據可以用來研究肉質水果生物學的各個方面，舉例說明了一些商業上重要的性狀，如質地、風味、香氣、顏色和代謝成分與轉錄和表觀遺傳調節機制有關的問題。

材料方法

作者選取番茄果實的6種組織結構（圖1a）和5種果皮細胞（圖1b），用激光微解剖(LM)或手工解剖的方法，在生長及成熟的10個階段進行取樣（圖1c），每個生物重複至少選取12個樣品。

圖1

採取的方法包括：

激光顯微解剖（LM）；RNA分離和測序；數據比對和轉錄表達分析；基因注釋和功能富集分析；果實解剖結構的可視化；加權基因共表達網路；透射電子顯微鏡分析；BiFC 分析；轉基因植物的構建和轉錄組分析；類胡蘿蔔素和乙烯的測量；McrBC-PCR等。

結果

1、番茄果實發育過程中的組織或細胞型RNA-Seq

迄今為止，大多數關於番茄果實的生物學研究都只關注於果皮，忽略了各種各樣的內部組織，而這些組織在果實生物學中扮演著不同的、潛在的重要角色。

本研究發現，在被解剖的果皮細胞/組織樣本中所表達的20732個基因中，有19494個在果皮樣本中被檢測到，這意味著1238個基因(6.4%)在果皮樣本中沒有被發現。

2、對關鍵果實品質性狀的時空分析

以往的研究總是基於大量的果皮組織的分析，試圖找出具有商業價值的水果品質性狀的基因。許多重要性狀的分子途徑被發掘出來，如質地、風味、香氣和代謝產物等。但本文作者依據高解析度的時空基因表達譜，以及對所有組織的整體考慮，為這些特異基因的時空表達提供了新的視角。

圖2a， 水果軟化相關基因在不同組織/時期的表達情況

圖2b， 水果風味相關基因在果皮細胞/時期的表達情況

3、基因的共表達網路分析

利用共表達分析可以識別功能相關的基因網路，精細的時空數據應該會產生更準確的網路預測。為了驗證這一想法，作者首先使用了一種先驗研究的方法，查找與查爾酮合成酶基因SlCHS-2共表達的基因。SlCHS-2基因編碼一種限速酶，該酶參與抗氧化劑類黃酮色素的生物合成，這些色素在成熟的番茄果皮中積累，SlCHS-2在果皮細胞中優先表達，在成熟後增加（圖2c,d)。在與SlCHS-2基因共表達排名前10的基因中，有6個基因在黃酮類生物合成途徑中的編碼酶，還有1個是轉錄因子（圖2e,f)。

圖2c， SlCHS-2基因在果皮細胞/組織中的表達量

圖2d， SlCHS-2基因在果實發育不同階段的表達量

圖2e， SlCHS-2基因以及協同基因在果皮細胞/組織，以及不同時期的表達情況，其中紅色基因表示黃酮類生物合成途徑相關調控基因

圖2f， 黃酮類生物合成途徑

4、預測生長素信號轉導中的蛋白質相互作用

全面的共表達分析也可以用來確定基因之間的相互作用，及其發生的條件、組織/細胞、發育階段特性。在此背景下，作者研究了與植物生長激素有關的蛋白質相互作用，該過程對果實發育有重要的意義。

植物生長素信號轉導是由生長素反應因子(ARF)和Aux/IAA家族成員之間的蛋白-蛋白相互作用介導的。

作者在不同的組織/細胞類型和發育階段對21個ARF和24個Aux/IAA基因進行了成對的表達分析。結果表明，在所有的ARF-Aux/IAA組合中，SlARF4和SlIAA15之間的相關性最高（圖3a）。作者採用雙分子熒光互補(BiFC)方法進行驗證(圖3b)，證實了它們的物理相互作用。

圖3a， 與生長激素信號相關的ARF和 Aux/IAA基因之間關聯程度圖

圖3b，SlARF4與SlIAA15的相互作用

5、碳代謝相關基因在不同細胞類型中的變化

番茄果實生物學研究中，碳水化合物的獲取和代謝至關重要。因為糖和有機酸的合成、代謝和積累，是影響番茄營養和商業價值方面的關鍵因素。與光合碳固定、儲存有關的基因和酶活性研究都以番茄果實的發育模式為對象，但在細胞/組織層面上的研究卻甚少。

在不同果皮細胞類型中，作者發現澱粉生物合成關鍵酶編碼基因在實質細胞中高表達（圖4a）。透射電子顯微鏡(TEM)分析顯示，在5DPA時，與內表皮相鄰的實質細胞主要含有原質體，其中含有堆疊的類囊體和澱粉顆粒，這表明葉綠體和澱粉體之間存在一種中間結構（圖4b c）。在10DPA時，原質體中的澱粉顆粒進一步發展，基粒結構被破壞（圖4d）。這一觀察結果與之前的報道一致，即澱粉主要聚集在果皮的內層，而作者發現，這是在實質細胞中發生的，而不是在內表皮。

圖4 果皮中原質體的細胞類型依賴性分化

a，與澱粉合成相關的基因表達量；e，與光合作用相關的基因表達量；b，透射電子顯微鏡(TEM)圖像顯示了在表皮內細胞層的原質體；c d，內表皮附近的實質組織；f g， 內表皮。

含有澱粉粒的原質體由紅箭頭指示，沒有大澱粉顆粒的葉綠體用藍色箭頭表示。

6、番茄果實成熟的時空調控

番茄成熟的過程通常與果皮的外部顏色變化有關，這反映了類胡蘿蔔素和類黃酮素的積累。Br階段是「打破」（break）外部顏色變化的節點（圖1c,d），實際上在此之前，果實的內部組織已經開始成熟。

作者發現WGCNA共表達模塊M6包含了許多與成熟相關的基因，包括TFs成熟抑製劑基因(RIN;圖5a)和非成熟基因(NOR)，它們是成熟的關鍵調控因子。在M6中，RIN形成了一個中央樞紐基因，這表明它是這個模塊中共同表達基因的主要調控因子。作者選取了成熟抑製劑RIN的靶向基因SlGRAS38，並通過RNAi沉默方法進行轉基因驗證。作者構建了6個SlGRAS38-RNAi沉默組，並在其中選擇兩組樣品（gras-13和gras-20）進行詳細研究。對WT（對照組），gras-13，gras-20的果皮樣品在Br時期取樣，檢測SlGRAS38基因的表達水平（圖5b），同時還進行了類胡蘿蔔素及乙烯的成分檢測（圖5c,e）。

實驗結果表明，SlGRAS38基因是一種新發現的RIN下游調控因子，並且可能參與了與類胡蘿蔔素和乙烯代謝相關的成熟過程。

圖5

7、成熟過程中表觀遺傳調控的空間變化

除了TFs和激素調節的網路外，表觀遺傳修飾，包括DNA甲基化的改變，也可以調節番茄果實成熟。作者發現與果實成熟相關的共表達模塊M6當中的SlDML2基因（DNA的甲基化酶基因），已經被證明能夠控制在關鍵成熟調控因子（如RIN）的啟動子失去5-mC。我們利用McrBC-PCR對RIN的啟動子中兩個區域（pRIN-1 和 pRIN-2）進行DNA甲基化情況分析（圖6a）。結果表明，這兩個區域存在相關聯的甲基化反應，在MG(pRIN-1)或Pk(pRIN-2)階段發生在心室組織先於果皮組織 (圖6b)。

結果表明了一種組織特異性表觀遺傳變化的模式——心室組織先於果皮組織啟動成熟程序，組織間的啟動子甲基化程度的差異在果實關鍵成熟調控和現象的表達上造成了時空差異。

圖6

討論

本文從組織、細胞類型、發育幾個方面，對番茄的果實進行了全面的轉錄組分析。基於RNA-seq方法的高靈敏度，能夠檢測出低丰度基因以及它們所在的特定細胞類型。此外，基於LM的樣品中檢測出1238個基因僅在果實內部組織表達，在果皮組織不表達，這表明了細胞類型特異性分析對功能研究的潛在價值。文章中，作者還描述了幾個數據集的例子，這些數據集闡明了與不同的水果個體發育階段相關的時空調節網路，包括控制細胞壁代謝的機制，以及揮發性芳香化合物、GABA和碳水化合物的產生。高解析度基因時空表達譜還是可以更準確地預測轉錄組與蛋白質相關性。此外，作者還展示了這些數據如何被用來預測蛋白質的相互作用，並舉例說明如何通過實驗證實這一點。總的來說，這些數據為後續的研究提供了一個平台，以解決在果實組織/細胞類型、生物學過程的特殊功能研究。

參考文獻：

Yoshihito S. et al.High-resolution spatiotemporal transcriptome

mapping of tomato fruit development and ripening.Nat. Commun.9,364(2018).

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