全基因組水平基因分型方法

3/10本期作者：大胖丫

1. 基因組水平重測序

該方法一般是需要一個相對完善的參考基因組序列，不同樣本先比對到參考基因組上，然後以參考序列為媒介再進行樣本之間的遺傳變異檢測。遺傳變異一般包括核苷酸變異（NVs）和結構變異（SVs）：NVs一般包括單個或幾個連續氨基酸的差異以及小片段的插入缺失（InDel，小於50bp），但InDel在NVs里的比例相對較少，比如對320份大豆的重測序共鑒定出了11M NVs，InDel只有不到10%；SVs是指大片段（>50bp）結構變化，主要包括刪除、插入、到位、異位和拷貝數變化等。SVs的檢測一般有三種方法：利用測序數深度的變化、利用paired-end的測序信息和利用剪切位點。利用測序深度的變化可以檢測目標區段的刪除（沒有read比對到參考序列中）、拷貝數（測序深度不均一）以及異位（沒有read比對到原始位置，但可以比對到插入位置）等變異；paired-end的序列由於在物理上是相鄰的，兩個read之間的距離也可通過建庫大小進行判斷，如果兩條read之間的距離有明顯變化則可以認為目標區域出現了插入或缺失；而對於其它類型的SVs，也可以利用paired-end之間的配對關係是否發生異常進行判斷；剪切位點的變化主要是用來檢測結構變異所造成的斷點或著連接點。雖然測序成本大幅度下降，但對於大群體的全基因組水平變異檢測來說，成本依然高昂。同時，由於測序數據十分龐大，存儲及分析都需要消耗大量的計算機資源。

2. 基於重測序的SNP晶元

重測序技術可以進行大規模的SNP檢測，基於這些SNP信息可以設計SNP晶元。SNP晶元是利用已知SNP位點兩側的特異序列設計探針，並將探針固定在固定相或晶元上，然後再將樣本的DNA片段化後與晶元雜交並掃描雜交信號，從而鑒定某一位點的基因型。主要有兩家公司在做，一個是Affymetrix，另一個是Illumina。目前在作物上有很多成熟的SNP晶元，比如水稻上的44K、50K和700K，玉米的50K和600K，小麥的90K、660K和820K等（doi.org/10.1016/j.molp.2017.06.008）。儘管SNP晶元的開發比較困難，但由於現成的SNP晶元操作簡單、價格低廉並且穩定性很高，在遺傳多樣性檢測、進化、全基因組關聯分析和分子標記輔助選擇育種等方面應用廣泛。SNP晶元也有其局限性，其一就是只能檢測已知的多態性位點，即無法檢測未知SNP；其二對於多倍體物種（比如小麥）、結構變異較多、遺傳多態性較高或重複序列區域的檢測準確度有所下降。

3. 簡化基因組測序（reducedrepresentation sequencing）

由於全基因組測序成本較高，並且數據處理也更加複雜，簡化基因組其實就是利用一些特殊的方法，比如用限制性內切酶進行酶切以富集特定基因組區域（GBS, genotyping by sequencing）或者利用目標區域捕捉（targetedsequencing）進行測序，對全基因組進行簡化，然後再進行測序和多態性位點的鑒定，其測序和數據處理的成本大幅度下降。簡化基因組測序不需要已知的多態性位點信息，其本質還是測序，通過測序來鑒定遺傳變異。

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