體內成骨破骨細胞的直接接觸可以動態調控其功能

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骨代謝是在成熟破骨細胞及成熟成骨細胞的相互溝通調節之下進行的，但是在體內兩種細胞之間的具體溝通方式還是難以捉摸的，在這次研究中我們首次採用了一種全新的活體骨組織成像方法，在活體組織內觀察成熟破骨細胞及成熟的成骨細胞之間的相互聯繫。儘管在骨組織內大部分的成熟破骨細胞和成熟成骨細胞都是離散分布的，但是在一定的時間空間內兩種細胞還是互相之間有著直接的接觸和溝通。除此之外我們還是用了一種全新的PH熒光探針來觀察破骨細胞在骨吸收過程中分泌氫離子的情況，結果發現在成熟破骨細胞沒有與成熟成骨細胞直接有接觸時其分泌氫離子時正常的，當其和成熟成骨細胞接觸時分泌的氫離子減少。說明成熟的成骨細胞可以一直破骨細胞的分泌氫離子，甲狀旁腺激素可以通過增加兩種細胞的混合情況來促進骨合成代謝。總的說來這篇文章通過活體成像技術在一定的時間空間內展現了成熟破骨細胞與成熟成骨細胞之間的相互作用進而影響到骨組織的代謝。

在骨代謝過程中，以破骨細胞的骨吸收開始接下來成骨細胞形成新的骨，這個過程不同步的貫穿發生在骨組織基本多細胞單位（BMUs）,骨代謝受到到每個BMUs單位的嚴格調控，每個BMUs中的成骨細胞和破骨細胞間的複雜細胞信號傳導共同來調控這一過程。

在過去的20年中活體雙光子顯微技術飛速發展，得益於相關技術的飛速發展，我們可以在活體組織內觀察細胞之間的相互聯繫。採用新的這種技術我們在活體骨組織內可以看到由ECFP青藍色熒光蛋白標記的成熟成骨細胞和tdTomato紅色熒光蛋白標記的成熟破骨細胞。作者首先構建了ECFP小鼠，且論證ECFP的小鼠成骨細胞可以正常表達ECFP具有正常成骨細胞的功能，與tdTomato小鼠雜交獲得了Col2.3-ECFP/TRAPtdTomato小鼠。

Fig1.

Fig1a.b取材來自活體小鼠的顱蓋骨，藍色熒游標記成骨細胞，紅色熒游標記紅色蛋白。

Fig1c截取於b中的離散分布區域空心箭頭表示兩種細胞沒有直接接觸，d圖截取於虛線區域，實心箭頭表示兩種細胞直接互相接觸。

Fig1e.f利用雙光子顯微鏡延遲拍攝技術在8小時內我們可以觀察到未直接接觸的細胞之間間距的變化。

fig1.g 顯示接觸區域中相互接觸的兩種細胞也會隨著時間運動。

Fig1.h通過構建3d視圖我們發現黃色區域所示的接觸區域也是隨著時間在不停地變化的。

由此不難發現在活體內部破骨細胞與成骨細胞運動相當的活躍，且兩種細胞在體內的直接接觸只在少部分區域被發現，大部分的破骨細胞與成骨細胞是離散分布的。

在了解活體內破骨細胞與成骨細胞的具體分布情況後，作者為了進一步探究破骨細胞的骨吸收能力。作者採用一種綠色熒游標記的PH探針來衡量骨吸收能力，採用骨吸收指數BRI反映其吸收情況，數值越大骨吸收能力越強。

Fig2 a.b選取盡量大區域的破骨細胞面積來計算BRI（bone resorbing index）值，c.d圖展示了文中的BRI值計算方式是破骨細胞存在區域中ph探針信號與非破骨細胞存在區域中的ph探針信號的比值。

Fig2 f.g顯示非連接區域內BRI值明顯高於直接接觸區域。

BRI值計算髮現，破骨細胞與成骨細胞直接接觸抑制了破骨細胞的骨吸收能力。接下來作者給與小鼠PTH刺激觀察對活體內破骨細胞和成骨細胞狀態的影響。

Fig3.a b 經過CT掃描發現再給與PTH刺激後骨量明顯增加

Fig3.d-f；給與小鼠PTH與對照組相比1w後破骨細胞數量明顯增多，給與PTH後3w和6w混合區域內的兩種細胞數量明顯上升，直接接觸也顯著增加。

Fig4.a細胞原始圖像。b經過計算機處理後將破骨細胞和成骨細胞像素化以便與後續計算。c以各個像素間的距離為標準將像素化的細胞分層聚類。

Fig4.d GLI(Gini-like impurity)基尼不純度，通過破骨細胞和成骨細胞中在每個簇中的加權平均值計算。這裡代表了每個分簇中的細胞混合程度，GLI值越高說明細胞混合越多。

Fig4.e-f 再給於PTH刺激6w後每個分簇中CMI顯著增加，提示PTH促進了破骨細胞與成骨細胞之間的接觸與溝通，但是細胞的接觸時間並沒有統計學上的差異。

Fig5.a使用三維成像技術觀察給與PTH刺激後活體內破骨細胞與成骨細胞的接觸情況，在3w及6w後接觸數量明顯增加（圖中黃色標記所示）

Fig5.b-e相互接觸細胞的數量是明顯增加的但是在3w和6w後接觸區域內的破骨細胞和成骨細胞的絕對數量是沒有明顯變化的，說明PTH不僅僅是通過增加細胞密度來促進兩者的接觸的。

經過分層聚類的方法使用GLI來計算CMI(cell mixture index)細胞混合指數，CMI越高說明細胞接觸越多。給與1w的PTH後CMI與對照組無顯著差異，但是3w和6w後明顯增加，通過三維共定位分析我們得到了同樣的結果，而且細胞表面接觸面積同樣增多了，所以兩種細胞的接觸增加不僅僅是細胞密度增加的結果，而確實是在給與PTH刺激後細胞之間直接聯繫直接的結果。但是連接持續時間是不變的。

Fig6.a給與不同時間段PTH刺激後我們發現b圖中破骨細胞數量增加而且骨吸收區域增加，C 3wPTH刺激後破骨細胞數量相對於1w減少成骨細胞數量增加骨吸收區域減少，d 6wPTH刺激後骨吸收區域進一步減少。

Fig6.e 計算BRI值，1w較對照組有明顯上升，3w6w後下降，f細胞混合指數在3w後明顯上升，說明細胞的混合程度（即兩種細胞間的直接接觸）與骨吸收指數成反比。

在給與PTH刺激後，破骨細胞的數量相比1w後的成骨細胞數量增加而且大多數的破骨細胞是不和成骨細胞接觸的其獨立分泌氫離子，在PTH治療的後期階段成骨細胞的數量增加，而且成骨細胞與破骨細胞之間的直接聯繫也增多，這些共同的效應導致骨吸收減弱，3w和6w的骨吸收能力減弱，證明PTH是通過加強破骨細胞與成骨細胞的直接接觸來減弱骨吸收效應的。

在這次的研究中我們發現骨形成與骨吸收的區域是分開的這與先前的研究是一致的，破骨細胞與成骨細胞的接觸程度與破骨細胞的骨吸收能力是負相關的，與其運動能力成正相關。大多數的破骨細胞是以樹突狀的觸角連接到成骨細胞，在與破骨細胞相連時這些觸角非常的活躍，使這些破骨細胞表現出更高的運動性，這一發現與之前研究中破骨細胞分為具有骨吸收功能的R型和不具有骨吸收功能的N型相一致，與成骨細胞的接觸會促進R型破骨細胞轉化成N型破骨細胞。骨重建過程包括不同的階段包括激活、吸收、反轉和形成。在逆轉階段，破骨骨吸收停止，破骨細胞凋亡，骨形成激活。破骨細胞成骨細胞的直接接觸被視為反轉階段的一部分，來之成骨細胞的抑制信號被認為是有效阻止在同一區域發生骨吸收和骨形成的重要原因。而且可以有效的改變吸收階段轉化成形成階段，這可以合理的解釋骨重建的過程。

參考文獻：

1 Furuya M, Kikuta J, Fujimori S et al. Direct cell-cell contact between mature osteoblasts and osteoclasts dynamically controls their functions in vivo.Nat Commun2018;9:300.

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