CRISPR技術幫助發現治療漸凍人症的新靶點

▎葯明康德/報道

肌萎縮側索硬化病 (amytrophic lateral sclerosis，ALS) 俗稱漸凍人症，是一種漸進並致命的神經退行性疾病。患者由於運動神經元的逐步死亡，導致肌肉功能退化，像刷牙、說話甚至呼吸這樣簡單的肌肉運動都最終無法進行。在患者大腦中出現的異常蛋白沉積是ALS的重要標誌之一，但是科學家們並不清楚這些蛋白沉積如何導致神經元的死亡。日前，斯坦福大學 (Stanford University) 的研究人員利用CRISPR/Cas9基因編輯技術對影響ALS癥狀的基因進行了篩選，研究結果不但幫助科學家們進一步了解了ALS的發病機制，而且為治療ALS提供了新靶點。

▲圖片來源：123RF

在ALS患者中，很常見的一個病因是在C90RF72基因上出現的六核苷酸重複序列擴增(hexanucleotide repeat expansion)，發生變異的基因會表達非常容易聚合的二肽重複(dipeptide repeat，DPR) 蛋白。這種DPR在細胞中的沉積被認為是導致神經細胞死亡的原因。

這項結果發表在《Nature Genetics》的研究中，研究人員利用CRISPR/Cas9基因編輯技術在名為K562的人類細胞系中進行了全基因組敲除篩選 (genome-wide knockout screens)。CRISPR技術通常被用於修改基因序列，但是在這項研究中，它被用於在細胞中讓人類基因組中的特定基因失活。然後研究人員將DPR蛋白加入到培養細胞的培養基中，檢測在細胞中敲除特定基因讓它們對DPR引發的細胞毒性更為敏感還是產生抗性。

▲圖片來源：123RF

研究人員首先在人類細胞系中對人類基因組中的所有基因進行了篩選，他們發現有幾百個基因能夠對DPR的細胞毒性有正面或者負面的影響。為了在與ALS更為接近的細胞環境下檢驗這些基因的功能，研究人員在模擬ALS的小鼠神經元細胞培養模型中對在人類細胞中對DPR毒性影響最大的大約200個基因進行了進一步檢測。經過兩輪篩選，研究人員發現十多個基因對DPR的細胞毒性有最大影響。

在這十幾個基因中，有幾個基因被敲除之後會對細胞產生很強的保護作用。例如，名為RBA7A的基因是一個內溶酶體運輸基因 (endolysosomal trafficking gene)，它可能在媒介DPR侵入細胞和在細胞之間的轉播中起到重要作用。

而另一個受到研究人員關注的基因是Tmx2，當它在細胞中被敲除時，幾乎100%的細胞在DPR存在的環境下能夠存活，而通常只有10%的細胞能夠存活。

「你可以想像Tmx2 蛋白可能會成為一個好的藥物靶點，」 文章的第一作者，斯坦福大學的研究生Michael Haney先生說：「如果你有一個小分子化合物能夠通過什麼方法抑制Tmx2的功能，那麼它有可能成為治療ALS的療法。」

Tmx2蛋白是在細胞內質網中的一種蛋白，它的功能還沒有得到完全澄清。已有研究認為它可能在媒介內質網對環境中應激因子的反應中起著重要作用，特別是它可能觸發細胞死亡。在這項研究中斯坦福的學者們認為Tmx2能夠調節其它啟動細胞死亡程序的基因。

「我認為理解Tmx2蛋白在細胞中的正常功能是下一步需要解決的問題，這會幫助我們發現當有毒蛋白殺死細胞時哪些功能受到了影響，並且指出我們應該繼續考察哪些信號通路，」 文章的共同第一作者、斯坦福大學的研究生Nicholas Kramer先生說。

而在這項研究中使用的CRISPR篩選技術可以被用來研究其它疾病的信號通路。目前這項研究的團隊正在試圖使用同樣的技術來研究其它由於毒性蛋白沉積造成的神經退行性疾病，其中包括亨廷頓病(Huntington』s disease)，帕金森病 (Parkinson』s disease) 和阿茲海默病 (Alzheimer』s disease)。「我認為這是CRISPR篩選的一項非常令人興奮的應用，而且它才剛剛開始，」 文章的資深作者、斯坦福大學的遺傳學教授Michael Bassik博士說。

參考資料：

[1] Potential drug targets for ALS revealed in Stanford-led study using CRISPR

[2] CRISPR–Cas9 screens in human cells and primary neurons identify modifiers of C9ORF72 dipeptide-repeat-protein toxicity

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