10個方面保證16S微生物組研究中的最佳一致性

失之毫釐，謬以千里。這句話用在百變的微生物組研究中最正確不過了。

下面結合取樣、樣品存儲、DNA提取、文庫準備、測序和分析等10個關鍵因素說說，如何系統和周到的在現有技術下保證16S微生物組研究中的最佳一致性？

全文約3800字，建議閱讀時間7分鐘。

01 樣本採集

1、採樣點：不一致的採樣點可能會引起微生物群落變化，比如：胃腸道、呼吸道的不同部位，不同的土壤深度等。

2、採集方法：不同樣本採集方法、非侵入性／較少侵入性的方法能否替代侵入性採集方法說法不一。例如，研究顯示，人腸道拭子和活檢標本、呼出氣冷凝液和肺刷、經口留置胃管和瘺管採樣菌群差異顯著；牛瘤胃的一項研究則顯示，不同的採樣方法差別不大；另外，鼻拭子和活檢樣本、直腸拭子和糞便樣本菌群組成又差異不大了。缺乏共識和標準化的情況下，採集方法的一致性和預實驗就十分重要了。

3、均勻度：重要的事說三遍，混勻！混勻！混勻！尤其在腸道、土壤等高複雜或大尺度採樣時。

Note：參考已有／文獻中數據時，首先看採樣方法是否一致，盡量避免來自不同採樣方法的數據的比較。同一項目的待比數據盡量保證採集條件、標準和方法的一致性。

02 樣品存儲

新鮮樣本、直接提取時最好的選擇，如果不能，最權威的做法無疑是快速冷凍到-80度。

新鮮VS冷凍樣本：

兩項研究表明，冷凍樣本中F/B明顯升高。Fouhy et al的研究顯示，冷凍的影響只到屬，門、綱水平群落無甚差異。DNA提取前把糞便樣本冷藏個24h或72h，微生物組成和多樣性都不會造成太大差異。

Lauber等在不同溫度下儲存土壤、糞便和皮膚樣本，發現儲存時間對菌群結構和多樣性沒有顯著影響。－80 oC存儲2年，群落變化很小，僅 OTU數目減少，lactobacilli and bacilli丰度略有增加。

Note：最好新鮮樣本即時處理，如若不行，可以按不同保存時間等設置不同批次，處理方法、存儲時間和DNA提取批次的記錄很重要。

03 使用保護劑

McKain等人探討了使用低溫保護劑(即甘油/磷酸鹽緩衝液)來存儲瘤胃樣品的效果，qPCR發現，沒有使用冷凍保護劑的冷凍樣品存在擬桿菌的顯著損失。

Choo等人比較了使用幾種常用保護劑 (即RNAlater, OMNIgene.GUT 和Tris-EDTA)和-80oC直接乾燥凍存的糞便樣品的菌群分布，發現OMNIgene.GUT效果最好、差異最小；Tris-EDTA處理組發現一些重要的細菌類型如Escherichia-Shigella,Citrobacter 和 Enterobacter發生了顯著改變；效果最差的是RNAlater，菌群結構發生劇烈變化。

Note：選用保護劑保存樣本時，十分重要的是，所有樣本的處理一致（選用同一種保護劑）。

04 DNA提取

可能影響提取和下游PCR實驗的原因包括：

1、某些難於裂解的微生物細胞，包括細菌內生孢子和革蘭氏陽性菌等，影響提取效率。

2、抑製劑（來自環境、土壤、糞便中的殘骸、有機物等）可影響下游PCR效率，常見的抑製劑主要是有機質（如腐植酸、膽汁酸鹽和多糖等）和一些無機質（如鈣離子）。

提取方法上，手提最經典的方法就是酚-氯仿提取法。此外，適用於各種樣本類型的商用試劑盒也非常豐富，這裡不多介紹。值得注意的是，很多文獻都顯示，不同的提取方法可能引發微生物群落的劇烈變化。

Note：所有樣本的提取盡量採用一致的方法，在保證特定物種成功提取的情況下儘可能的提高產量和質量。得率的優化可以從核心步驟bead beating開始，建議預先優化整體protocol。

05 文庫構建

1、區域和引物選擇：基於主流測序平台，目前常見的16S rRNA測序區域選擇以V4（適用於2 X 250測序）和V34（適用於2X 300測序）等為主，然而事實上，沒有哪種引物是真正通用的，多項不同區域的比較研究給出了各種各樣的結論。值得注意的是，針對特定關注的微生物類型，也可以選擇一些特定的區域擴增。不同引物可能導致相對丰度和物種豐富度的改變，進而改變微生物群落結構。

2、PCR循環數：降低PCR循環數可以減少嵌合體的產生。

3、高保真聚合酶：不同的聚合酶對特定細菌群和整體細菌群落結構有顯著影響。

4、起始DNA量：PCR反應的起始DNA總量也可能影響細菌群落結構。

Note：16S測序中並沒有真正的「金標準」，重要的是選擇盡量適合的引物，考慮到PCR試劑和PCR條件的優化，並在研究中保持一致。

06 測序平台

07 模擬細菌群落

1、Mock Communities：已知比例的預混合細菌群落是一個很好的量化誤差的方法。模擬群落可以從美國標準菌庫（ATCC）或Zymo Research獲得。

2、Spike-in standards：在每個樣本中添加標準物，以在單樣本基礎上進行質量控制。為防止與樣本序列存在交叉，此處要選擇不太可能出現在感興趣樣本中的細菌，或者in silico設計的和資料庫中有差異的序列。

Note：推薦！

08 分析策略

流程和分解步驟的分析軟體和資料庫，在之前的文章中做過詳細解釋和點評,9個模塊＋40餘款軟體＋老司機辣評 | 16S信息分析流程軟體和資料庫合集。

這裡補充一項，基因拷貝數校正：

不同的細菌類型16S rRNA基因拷貝數有所不同，想要準確獲知真實的拷貝數信息比較難。

但是，目前已經有一些工具，可以利用序列資料庫和系統遺傳信息來校正拷貝數變化。其中包括Copyrighter、rrNDB、picanteR包和pplace中的函數，以及功能預測工具PICRUSt也包含有拷貝數校正的功能。

然而，既然是基於資料庫，那麼，考慮到資料庫中的信息數量，仍然是不夠全面的。

09 污染問題

DNA提取試劑盒、PCR試劑和實驗室環境中產生的微生物DNA污染在研究低微生物量樣品時可能會造成非常嚴重的影響。

1、陰性對照（或僅僅只有試劑）可以比較好的發現問題。

2、處理之前的隨機抽樣可能有助於減少此類問題發生。

具體的解決污染的方法：

1、去除PCR試劑背景污染物的擴增：Primer-extension PCR(對其他來源污染沒有影響)

2、去除試劑和實驗室環境中的DNA污染：紫外線和γ輻射、酶處理、硅基膜過濾、CsCl2密度梯度離心法、漂白劑/CoPA溶液處理等。

Note：想要開展靠譜的16S研究，建議包含reagent-only controls（例如，DNA提取試劑盒和PCR控制）。

10 模擬細菌群落

1、Mock Communities：已知比例的預混合細菌群落是一個很好的量化誤差的方法。模擬群落可以從美國標準菌庫（ATCC）或Zymo Research獲得。

2、Spike-in standards：在每個樣本中添加標準物，以在單樣本基礎上進行質量控制。為防止與樣本序列存在交叉，此處要選擇不太可能出現在感興趣樣本中的細菌，或者in silico設計的和資料庫中有差異的序列。

Note：推薦！

馬上要做16S測序了，來劃個重點吧：

記錄並保存好所有實驗中的原始數據

研究方法不同時，比較需謹慎。

儘可能從新鮮樣本中提取DNA，或在相同的時間內用同樣的方法保存樣本。

採用beat beating DNA提取方法可讓細胞裂解更充分。

參考文獻選擇適合的引物（注意：通用引物往往不通用！）

對完全重疊的reads去冗餘，使研究結果更接近真實微生物群落。

在測序的每一個run里設置模擬微生物群落。

在每個run中做一個只有試劑的陰性對照，進一步避免潛在誤差。

除此之外，最重要的是，良好的是實驗設計，以及從樣品製備一直到後期分析的方法一致性。

/End.

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回復文字：果然科學，看一篇好玩的科普文。

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