首發：《PNAS》博奧晶典助力國內科研人員應用10X單細胞轉錄組技術解析肺泡一型細胞亞型異質性

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研究熱詞

10X Genomics平台單細胞轉錄組測序、

肺泡發育和再生、

譜系追蹤

來源：測序中國

肺泡I型（AT1）細胞對肺的氣體交換功能至關重要，同時在損傷誘導的肺泡再生期間具有肺泡可塑性，其在肺泡發育和再生過程中存在著異質性。北京生命科學研究所的湯楠教授近期使用10X Genomics單細胞轉錄組測序技術在肺泡發育和再生研究領域取得突破性進展，發現Igfbp2是一種高度特異性的AT1細胞終末分化的遺傳標記，該文章也是中國大陸第一篇使用該技術發表的文章。

肺泡上皮細胞不僅對肺氣體交換功能至關重要，而且還是保護身體免受危害的重要屏障。響應急性損傷時，肺泡能夠快速修復和再生新的肺泡上皮細胞以恢復完整的上皮屏障。它主要由兩種類型的上皮細胞組成：肺泡I型（AT1）和II型（AT2）細胞。AT2細胞是較小的立方形細胞——具有合成和分泌肺表面活性物質的功能，另外，AT2細胞在培養過程中可以分化為AT1細胞並在肺泡內穩態同時進行損傷修復；AT1細胞是大鱗狀細胞，覆蓋於95％的肺泡表面並形成薄層氣血屏障的上皮組分。目前已知肺泡I型（AT1）細胞對肺的氣體交換功能至關重要。 AT1細胞在損傷誘導的肺泡再生期間具有細胞可塑性。然而，AT1細胞群在個體發育身兼數職，那麼它如何實現的呢？

本研究利用10X Genomics平台在大規模單細胞水平研究個體出生後AT1細胞發育變化，找出其發育中特異性遺傳標記—Igfbp2，並使用Igfbp2結合譜系標記，免疫染色在肺泡發育期間（體內）和PNX（體外）來驗證，鑒定出生後的AT1細胞群實際上有兩個AT1細胞亞型（Hopx+Igfbp2+和Hopx+Igfbp2?AT1細胞），在肺泡再生過程中具有不同的細胞命運。（圖1）

圖1 利用10X Genomics平台大規模單細胞RNA-seq解析肺泡AT1細胞的發育和再生機制

圖2 scRNA-seq分析AT1細胞從P3期到P60期，不同基因表達的變化趨勢

圖3 肺解離後P60期，AT1和AT2細胞分選scRNA-seq分析的示意圖

圖4 AT1和AT2細胞scRNA-seq分析的t-SEN和富集圖

結合已知的和新鑒定的AT1細胞標記，發現Igfbp2是成熟AT1細胞中最具特異性的生物標記基因之一（圖5和圖6）。有趣的是，發育過程表達Igfbp2的細胞部分在出生後AT1細胞中增加，而典型的AT1生物標誌物基因如Pdpn，Hopx，Aqp5和Ager在幾乎所有的AT1細胞中均不變地表達（圖2）。用針對Igfbp2（綠色）和Hopx（紅色）的抗體分析E18.5和P30小鼠肺（圖7）。在P1中，只有不到20％的Hopx+AT1細胞對Igfbp2表達有陽性表達。15分鐘後，Hopx+Igfbp2+AT1細胞的百分比增加到85％。到P60，有95％的Hopx+AT1細胞對Igfbp2表達呈陽性。E18.5肺中的Hopx+AT1細胞不表達Igfbp2；P60肺中少於5％的Hopx+AT1細胞不表達Igfbp2。以上免疫染色結果顯示5％Hopx+AT1細胞不表達Igfbp2，與我們針對肺P60的scRNA-seq結果一致。(圖2，右)

圖5 scRNA-seq分析鑒定先前未知的P60肺AT1和AT2細胞的生物標誌物

圖6 mRNA表達水平的定量實時PCR分析

圖7 Igfbp2在AT1細胞中特異性表達（圖B1,958個細胞；圖C和D總共3,377個細胞; 圖E和F總共2,691個細胞；n = 5隻小鼠；A，C，E和G-I，25um）

總結一下

① Igfbp2是一種高度特異性的AT1細胞終末分化的遺傳標記。

② 成熟AT1細胞群包含兩種不同類型的細胞：95%Hopx+Igfbp2+和5％Hopx+Igfbp2-AT1細胞。

③Hopx+AT1細胞終末分化為 Hopx+Igfbp2+AT1細胞亞型;但它們不能轉分化成AT2細胞，並且在肺泡再生過程中不能增殖，佔95%。

④Hopx+Igfbp2-AT1細胞，占成熟的Hopx+AT1細胞5％以下，可分化成AT2細胞，從而有助於肺泡損傷後再生過程中修復組織的完整性。

這項研究基於10X平台的群體單細胞轉錄組測序技術證實AT1細胞群在肺泡發育和肺泡再生期間實際上由兩種不同的AT1細胞類型組成，其中單細胞轉錄組建庫實驗在博奧晶典完成。對Igfbp2是AT1細胞終末分化的強大和可靠標記的證明將使未來能夠控制AT1細胞在發育，疾病和肺再生中功能的遺傳和細胞機制。在AT1發展中Igfbp2的功能仍有待闡明。因此，很明顯未來的研究將需要精確定義AT1細胞中Igfbp2和其他IGFBP家族成員的生物分子功能。

Yanjie Wang et al , Pulmonary alveolar type I cell population consists of two distinct subtypes that differ in cell fate.(PNAS).IF=9.423

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