兩文一綜述！PNAS連續重磅！RNAi技術又上一層樓！

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導 讀

RNA干擾（RNAi）是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA（dsRNA）誘發的同源mRNA高效特異性降解的現象。近幾年來RNAi研究取得了突破性進展，由於使用RNAi技術可以特異性剔除或關閉特定基因的表達，所以該技術已被廣泛用於探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療領域。2018年伊始，《PNAS》連發兩論文一綜述，讓RNAi的研究更加如火如荼。

呈遞問題的解決

在RNAi過程中，特殊的酶能將RNA切成小片段（siRNA或miRNA），並與特殊的蛋白（Argonaute蛋白，尤其是Argonaute 2（Ago2）蛋白）相結合，從而抑制靶向信使RNA翻譯。siRNA藥物可以在特定基因水平上起作用，可以遞送到胞質溶膠中，並且不需要運輸到細胞核中或與染色體DNA相互作用。然而，正如其他DNA和RNA候選藥物一樣，siRNA藥物也正面臨著無法進行有效呈遞的問題。這些大分子會被體液中的核酸酶迅速降解，並且經歷腎臟和肝臟的快速清除，嚴重的有可能引發不利的先天性免疫反應，想要提高siRNA藥物的療效和安全性，首要解決的就是呈遞問題。

Jiahe Li帶領的研究團隊藉助不同的傳遞載體，以RNAi的中央效應蛋白Argonaute 2（Ago2）為平台增強RNAi。他們發現siRNA和Ago2之間的物理聚集對於RNAi的增強不可或缺。同時他們還發現某些聚胺可調節siRNA / Ago2介導的RNA，他們藉此使致癌基因STAT3沉默並顯著延長了黑素瘤小鼠的存活率。該研究結果以《Structurally modulated codelivery of siRNA and Argonaute 2 for enhanced RNA interference》為題發表於2月5日的《PNAS》上。

siRNA / Ago2進入細胞示意圖

Li等將雙鏈siRNA和Ago2蛋白包裝到具有相同骨架但聚乙烯二胺重複不同的聚胺的陽離子側基上。研究人員發現，在哺乳動物細胞中，與其他三種Argonaute蛋白相比，Ago2顯得更為重要。在RNA誘導的基因沉默複合物形成和mRNA翻譯時，siRNA的載體鏈被切割並從Ago2分離，而反義siRNA鏈載入的Ago2卻可持續識別並切割靶mRNA。這項研究結果為改進RNAi技術功效提供了新方法。

siRNA / Ago2引起的基因沉默

siRNA / Ago2聚胺引起的基因沉默

研究人員對聚胺合成的呈遞載體的設計參數和由此產生的siRNA / Ago2的基因沉默效率進行了研究，併合成了一系列衍生自L-天冬氨酸苄酯骨架和N-羧酸酐的聚合物，這種聚合物主鏈已被證明是相對安全的，側鏈為多胺結構，這些適當的側鏈操作不僅實現了高效率呈遞，還阻止了負面影響的產生。這些研究表明，再編碼的Ago2在基因沉默中發揮的重要作用，可以以不同的方式調節基因。儘管這些影響目前歸因於聚合物和siRNA以及Ago2之間的物理作用，但是這些研究結果將引導科學家對納米級效應機制的詳細研究，並對siRNA在體內穩定性的研究會有所幫助。另外，研究人員發現優化的多胺/抗STAT3 siRNA / Ago2複合物可使腫瘤負荷降低並使小鼠存活率改善，這表明結構優化的siRNA / Ago2具有治療的潛力。

多胺側鏈結構穩定了siRNA和Ago2之間的納米級相互作用

特異性問題的解決

雖然CRISPR技術能夠達到永久改造基因的效果，但在許多疾病中沉默基因會建立短期效應，其在mRNA水平上的基因表達無法完全阻斷，還會減少相應的目標效應。想要準確識別這些短期效應，就需要具有極強特異性的工具，解決RNAi技術的特異性問題已經迫在眉睫。

在3月12日一篇題為《Programmable RNA recognition using a CRISPR-associated Argonaute》的文章中，Audrone Lapinaite等人將焦點聚集於Argonaute（Ago） 蛋白上。研究人員發現，使用5-溴-2"-脫氧尿苷（BrdU）體外重建的CRISPR相關的Ago複合物Marinitoga piezophila Argonaute-gRNA（MpAgo RNP）可顯著增強其對RNA靶標的特異性和親和力。他們藉此繪製了gRNA的種子區域，並鑒定出決定其靶向特異性的gRNA的核苷酸。

在一些細菌中，Agos與CRISPR基因座相關，並使用非經典的5"-羥基化的指導RNA（gRNA）進行核酸靶向。研究人員發現MpAgo很容易用gRNA編程來形成RNA-蛋白質複合物（RNP）。重建的MpAgo RNPs只能以中等的親和力和特異性結合完全互補的RNA底物，在gRNA的5"末端摻入5-溴-2"-脫氧尿苷（BrdU）後，使MpAgo RNP快速穩定，並大大提高了MpAgo RNP的親和力和特異性。此外，具有5"-BrdU gRNA的MpAgo RNP可選擇性結合僅相差一個核苷酸的底物，實現了從複雜的混合物中分離出肌苷編輯的RNA底物。這些發現拓寬了研究人員對Ago與底物RNA相互作用的機理理解，並證明MpAgo RNP可以用作高度特異性的RNA靶向平台來研究RNA。

具有5"-BrdU gRNA的MpAgo RNP特異性結合ssRNA

gRNA的種子區域

另外，研究人員測試了gRNA的5"端核苷酸是否影響MpAgo RNP結合和切割RNA的能力。他們使用與gRNA完全互補或非互補的RNA底物，檢查了gRNA的5"-末端核苷酸是否影響體外ssRNA亞基結合效率和特異性。研究結果表明高效切割不需要ssRNA底物的緊密結合，gRNA的5"端核苷酸也不影響MpAgo RNP的結合能力。他們藉此繪製了gRNA的種子區域，並鑒定出決定其靶向特異性的gRNA的核苷酸，順利解決了RNAi療法的特異性問題。

3月16日，Rangaramanujam M. Kannan發表了題為《Toward new design principles for superior gene silencing》的綜述，對上述研究做了相應分析。文中指出，通過明確的設計原則，改進的siRNA包裝，可以有效解決siRNA的呈遞和Ago蛋白的特異性問題，為RNAi療法開闢新的途徑，從而實現個性化的精準藥物。

參考資料：

1. Structurally modulated codelivery of siRNA and Argonaute 2 for enhanced RNA interference

2. Programmable RNA recognition using a CRISPR-associated Argonaute

3. Toward new design principles for superior gene silencing

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