「同位素標記」在藥物研發過程中的那些事

題記

記得，同位素、同位素標記這些辭彙首次被輸入進大腦，可追溯到少時學習「光合作用」的年代...是啊，我們曾經學了那麼多東西，真正能用到日後工作中的，又能有多少？而這眾多的「知識點」，倘若能在日後有所接觸，就已經十分不易了...曾經的同位素標記，告訴了我們「光合作用中釋放的氧到底是來自於水，還是來自於二氧化碳」，而今天工作中的同位素示蹤，又能告訴我們哪些信息呢？而我們又需要了解哪些與藥物相關的同位素信息呢？筆者作為一名藥物合成人員，作了如下歸納總結，希望能對君有益！

同位素簡介

同位素為相同化學元素的原子，由於在原子核中存在不同的中子數而具有不同的質量，有輕、重同位素之分；根據物理特性，又可將同位素分為放射性和穩定性兩種形式。放射性同位素(如：3H、14C)經歷著自身的衰變過程，並放射出輻射能，是不穩定的，具有物理半衰期；穩定性同位素無放射性，物理性質穩定，以一定比例(丰度)存在於自然界，對人體無害，可採取化學合成的方法將其標記到藥物分子中去，並通過氣質、液質等儀器對其進行跟蹤檢測。

「同位素標記」在藥物研發過程中的2個主要方向

&葯代動力學研究

在定量分析靈敏度方面，放射性同位素標記化合物要高於穩定同位素標記物，且放射性的測量不受非放射性雜質和化學狀態的影響，因此定量分析更加簡便，分析結果更加準確。放射性同位素標記化合物除了用於解決常規分析方法無法解決的分析難題，更重要的是可用作示蹤劑，從而來研究藥物在體內的分布、代謝、療效、作用機制等，為藥物的葯代動力學研究提供重要的依據，同時為創新藥物的研發提供方法。

&毒性研究

潛在毒性研究是藥物的發現和臨床過程中必須進行的一個環節，以往的毒性研究多採用對大量的化合物進行體外實驗和動物實驗，需要花費大量的金錢和時間，且對毒性產生的機理也無法解釋。使用穩定同位素標記的化合物可以追蹤藥物的代謝過程，找出毒性產生的原因，並能預測新化合物潛在的毒性。

「放射」VS「穩定」簡述

&放射性同位素標記

放射性同位素得以廣泛應用於活性物質示蹤主要依賴於其最重要的兩個特點：1)是與被示蹤的物質有同一性，即放射性核素與其同種元素的非放射性核素在化學和生物學行為上具有高度一致性，不致擾亂和破壞體內外生理過程的平衡狀態；2)是與被示蹤的物質有可區別性，放射性核素的原子核不斷衰減，發出能被放射性探測儀所探測的射線，從而實現對標記物的定量及定位。此外，放射性同位素示蹤技術還具有靈敏度高、專屬性強、適用性廣、檢測方法簡便等優點，因此在藥物ADME研究中得到了廣泛的應用，且美國FDA早已將放射性同位素標記藥物給葯後的葯動學數據作為新葯安全性評價的重要依據，並制定了相關指南。

&穩定性同位素標記

穩定同位素標記試劑較放射性同位素標記試劑而言，最主要的優點在於無放射性、無需複雜的放化設備及防輻射防護措施，且無環境污染。目前，在我國國內已完成了15N、18O、20Ne、22Ne、13C等穩定同位素分離技術的研究，並逐步將穩定同位素標記試劑的製備和檢測技術進行國產化研發，從而打破國外壟斷。

示蹤劑如何選擇？

&放射性同位素示蹤劑

在藥物ADME的研究中，常用的放射性同位素包括14C、3H、32P、33P、35S、125I、131I等。隨著小型PET儀器的發展，利用11C、13N、15O、18F等放射性核素進行ADME研究的實例也日漸增多。在放射性示蹤劑的選擇上，應根據實驗目的、實驗周期以及操作者安全等幾方面綜合考慮，包括所選放射性同位素的射線類型、半衰期、放射化學純度、比活度、毒性及標記位置等。常用的放射性示蹤劑多為單一放射性同位素標記的化合物，有時為了實驗的特殊需要，也可以採用雙標記或多標記的放射性物質，但此時選用的標記原子最好是不同能量或發射不同類型射線的核素。常見的有14C/3H、14C/125I、125I/131I等。

低能量的14C和3H是藥物ADME研究中最常用的2种放射性核素，這2種核素的半衰期分別為5730年和12.35年，由於其半衰期長，在實驗周期中測得的數據一般不需要作物理半衰期的校正，便於測量及結果計算。再者，14C和3H兩種元素髮射的β-射線能量較低，易於防護，並可用液閃技術測得，實驗操作及結果檢測十分方便。此外，14C和3H還可通過放射自顯影技術進行檢測，顯影清晰，這又進一步擴大了這2種核素的標記物在ADME研究中的應用。

&穩定性同位素示蹤劑

藥學領域常用於示蹤的穩定性同位素，主要為2H、13C、15N、18O。嚴格來講，穩定性同位素是指某元素中不發生或極不易發生放射性衰變的同位素，如12C和13C均是碳的穩定性同位素，且在代謝研究中，「穩定性同位素」常用來表示天然丰度比較低的那一種穩定性同位素。碳在自然界中主要以12C的形式存在，13C僅佔1.11%，氮元素則以14N為主，15N僅佔0.37%。

標記位置的選擇

在製備標記藥物前，首先要選好合適的同位素作為標記元素並決定標記的位置。作為示蹤研究用的標記藥物要使標記的原子盡量能代表該藥物整個分子在生物體內的作用，並且要注意到藥物在體內可能發生的變化。在選用作為標記原子的同位素時應考慮到藥物分子的結構，同位素的半衰期，射線的能量，是否易把標記原子引入以及示蹤試驗的特殊要求等因素。最常用的同位素有14C、3H和35S；有時也採用32P、131I。

14C作為最常用的放射性核素通常標記在分子的骨架結構上，其標記位點較為穩定；3H易與周圍環境中的1H發生交換，導致比活度下降，因此穩定性不如14C；此外，3H相對於14C來說有較明顯的同位素效應，也在一定程度上限制了其應用。不過在一般的示蹤實驗中，由同位素效應引起的誤差常在實驗允許誤差內，可忽略不計。此外，考慮到3H標記物的合成較為簡便，因此在3H標記物能夠滿足實驗需求的情況下，也常選用3H標記物作為示蹤劑。

除以上，在標記位點的選擇時，還可利用計算機輔助代謝物預測技術(CAMP)預測化合物分子結構中的穩定部位。一般來說，應首先考慮對分子結構中的芳香環或脂環上的C原子進行標記，而儘可能避免在羧基、羥基、巰基、氨基、亞氨基等活性部位進行標記。因為一旦這些不穩定基團脫離母體化合物，就失去了對母體藥物及主要代謝物的示蹤的能力。此外，標記位點還應遠離化學鍵斷裂位置，以避開同位素效應的影響。如果母體化合物在代謝過程中因化學鍵斷裂同時生成2個重要代謝產物，在母體化合物標記時可考慮採取雙標記技術。

同位素標記試劑的化學合成

&放射同位素標記試劑的合成

放射性化合物的合成製備，受限於其有限資源和高昂的費用，因此一般新葯進入實質性研發階段才採用放射性標記化合物進行示蹤研究。放射性化合物在藥物研發中的應用多數傾向於限制在臨床前或臨床研究階段。而進入臨床前和臨床研究階段之前的相關研究中通常可用直接氚化等新技術，如用氚水、氚氣、氚複合物以及近期發展起來的氚化試劑等目標化合物分子中直接引入氚原子，得到簡單的非定位氚標記目標化合物，而不必進行放射性合成方法進行定位標記。此類方法有一定缺陷，如在體內易於與體內的氫原子交換而導致原葯及其代謝產物失去放射性。但此類非定位標記方法有著放射性示蹤物易於標記，技術手段簡單、經濟等特點，而且足以完成新葯研究初期目標物質在體內外大致定性和定量目的。但新葯研究後期，化合物在體內ADME研究、代謝動力學研究及物料平衡研究等深入確切的定位定量，甚至進一步進行代謝產物的定性定量研究中需要穩定的定位標記化合物來完成。因此，用化學合成方法將新葯目標化合物中代謝穩定基團的C，H，I，F 等元素用14C，3H，125I，18F等放射性元素進行對應標記合成。標記合成一般採用含有放射性元素的簡單化合物，如3H2，14CO2，Na125I 等，在藥物合成的適當步驟中引入，並在製備操作、分離、分析時均需微量或超微量技術。

&穩定同位素標記試劑的合成

化學合成法合成穩定同位素標記有機或無機類試劑通過選擇合適的合成路線，設計適合實驗室規模實施的精密合成裝置和高效催化劑以及特殊精製純化裝置的設計、製造，使得原本在工業條件下合成的多種穩定同位素標記試劑得以在實驗室的溫和條件下高收率、高質量的完成製備。穩定同位素標記試劑的合成策略不僅要考慮純度和收率，更多的需要考慮工藝過程對目標產物丰度的影響。因此，需要根據目標產物的定位標記選擇合適的同位素原料，充分考慮合成環境對丰度影響因素等問題。例如，有機合成法製備穩定同位素13C標記試劑，合成路線的設計、空氣中CO2的影響、甚至設備材質的成分都會對13C同位素的丰度產生明顯影響，在合成穩定同位素D標記試劑時，空氣中微量的水分可能會對目標化合物的丰度產生較大的影響，製備過程中用到的大量含H元素的無機或有機試劑，也可能會對合成的D標記試劑的同位素丰度造成稀釋。

穩定同位素標記基礎試劑在穩定同位素標記試劑的化學合成中起著關鍵和決定性作用。通常情況下，穩定同位素的基礎原料是 H15NO3、13CO和 D2O，以有限的穩定同位素基本原料來合成穩定同位素標記基礎試劑，因而也就使得該類試劑的合成難於普通試劑。如13C或D標記甲醇的製備，常規甲醇的製備已是非常成熟的工藝，採用中高壓反應設備和工藝，條件複雜、單程轉化率低，需將CO氣體循環利用來得到高收率和高純度的甲醇，這樣的工藝完全不適合13C或D標記甲醇的合成。13C或D標記甲醇的合成是通過設計精密的催化加氫反應器和精餾裝置，以13CO 或 D2O為原料，添加自製的 Cu-Zn-Cr催化劑，採用精細控制的工藝條件，可使同位素原料的利用率達90%以上。又如15N標記水合肼的合成過程中，雖然參考了工業化水合肼的工藝過程，但為了提高穩定同位素原料尿素-15N2的利用率，除改變了反應所需的催化劑外，還對工藝條件進行優化，從而使15N同位素利用率達75%以上。13C、D標記的乙炔、苯、碘甲烷是引入穩定同位素標記基團的重要基礎試劑，製備的基本原則不僅要考慮同位素基礎原料的充分利用，同時要考慮合成產物的同位素丰度要達到99 atom%以上。

感悟

之所以總結以上內容，源於最近項目的進展。講真，新葯合成，這條路不易(當然，整個新葯研發鏈都不易...)。曾幾何時，藥物化學大部分工作都是在干化學，而如今，化學已僅僅成為了拿到目標化合物的一種手段而已。工作中，我們的精力不得不均分到各個學科當中(如藥理、毒理、質量、製劑...)，否則，學科間相互討論的時候，就尷尬了，且不利於項目的整體了解與把控。不過，雖然每天焦頭爛額、腳打後腦勺的忙碌，但這條道路卻又能帶來分外的充實，因為它不僅可以離科學更近一些，且倘若開花結果，是可以為無數的病患帶來健康和希望的。故每當想到於此，努力讓自己成為一名傳承中的「種樹人」，再苦再累，又有何不可呢！

參考文獻：

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3.Stable isotope compounds - production, detection, and application. Biotechnology Advances, In press, corrected proof, Available online 19 January 2018.

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7.蛋白多肽類藥物葯代動力學分析方法研究進展. CNKI

8.穩定性同位素標記試劑的研發及應用展望. CNKI

9.放射性同位素標記藥物的製備方法.CNKI

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