泛素化組學揭示VCP底物蛋白與維持細胞穩態性途徑

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編者按

含纈酪肽蛋白(Valosin-containing protein, VCP)又名P97，是進化保守的泛素化依賴性的AAA+ ATPases，通過adaptor蛋白與泛素化蛋白形成複合物，參與蛋白的remodeling和泛素化降解，具有維持細胞的穩態性等多種功能。然而儘管VCP在蛋白降解與重塑中的重要性，但人們對其底物的蛋白種類及特性知識知之甚少。

常規泛素化存在很難使用底物特異性抗體去鑒別其修飾情況和修飾位點的難題，而泛素化修飾組學能夠很好的解決這一困難。最近，來自德國的研究人員利用泛素化蛋白組學，鑒定了450個VCP的底物蛋白。研究發現很多蛋白參與基因表達調控，DNA修復，細胞周期等生物過程，同時還發現VCP參與調控重要轉錄因子c-Myc的降解。相關研究發表在著名學術期刊EMBO reports【1】。

關鍵詞：VCP; c-Myc; HUWE1; K6位泛素化；泛素化修飾組學

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研究思路和成果

含纈酪肽蛋白(Valosin-containing protein, VCP/p97，是進化保守的依賴泛素化的AAA+ ATPases，已知人的活性p97是六聚體。底物蛋白被泛素化體系（E1/E2/E3）泛素化後，在adaptor蛋白的幫助下，p97識別泛素化分子對泛素化的底物蛋白進行解摺疊，然後要麼被蛋白酶體降解，要麼被DUB去泛素化，實現recycling（圖 1）。

圖 1，AAA+-ATPase VCP/p97和其在泛素化途徑中的作用。

VCP本身沒有識別泛素化的結構域，是通過與包含泛素化結合區域伴侶蛋白與底物互作。VCP主要已知一些伴侶蛋白包括ubiquitin-X（UBX）或結合在VCP蛋白N端的UBX-like區域。目前VCP研究主要是在內質網相關的降解過程，主要是對內質網中錯誤摺疊的蛋白進行轉移向蛋白酶體進行降解。此外VCP也參與通過溶酶體自噬途徑對蛋白質聚集體（protein aggregates），應激顆粒(stress granules)和細胞器的降解。隨著研究深入也發現VCP介導的蛋白重塑也會涉及到細胞的其他器官如細胞核，線粒體外膜，而這些調節蛋白的重塑卻也並非與蛋白質降解有關。

研究人員首先利用SILAC技術對骨瘤細胞U2OS進行培養標記，採用VCP抑製劑NMS-873，蛋白酶體抑製劑MG132處理後，對泛素化蛋白進行質譜鑒定（圖 2）。WB實驗表明，VCP和蛋白酶體抑製劑後，蛋白的泛素化修飾水平都有上升。蛋白酶體受到抑制後的泛素化修飾較VCP被抑制更明顯。研究人員通過增加VCP抑製劑濃度，泛素化修飾水平並沒有發生繼續增加，表明VCP對泛素化修飾的改變是有選擇性。

隨後研究人員進行了泛素化修飾組學的定量分析。鑒定比較VCP和蛋白酶體之間對底物修飾的異同。在VCP抑製劑NMS-873處理後樣本鑒定到了7464個雙甘氨酸修飾位點的蛋白，其中63%和40%的修飾蛋白位點是分別在2或3個重複中鑒定到。抑制蛋白酶體後，45%泛素化位點修飾水平增加；而VCP抑制處理後，導致16%的修飾位點丰度位點增加。

圖2 VCP抑制後導致細胞的泛素化修飾普遍增加。

VCP抑制後，在泛素化修飾丰度增加兩倍的25個蛋白主要涉及到未摺疊蛋白應答（unfolded protein response）。涉及到非降解（non-degradative）的泛素化蛋白有核心組蛋白和核糖體蛋白，它們在VCP被抑制後的泛素化水平下調。

研究人員對7種泛素化鏈接模型進行了分析，其中VCP抑製劑NMS-873在處理6小時後，K6位泛素化修飾蛋白丰度較蛋白酶體抑製劑MG132處理後高4.6倍。為了證實這種現象不是由於泛素化池增加而導致的間接影響，研究人員觀察到K6位泛素化在VCP抑製劑NMS-873處理30min依然表現增高，而這個時間點遊離的泛素化多肽沒有發生變化。

由於K6位泛素化調節研究僅僅停留在泛素化連接酶parkin在自噬中自噬反應的報道【2】。研究人員結合VCP被抑制後的K6位泛素化修飾蛋白質譜鑒定結果發現83個在四個重複中持續性出現的蛋白，這些蛋白涉及到受體胞吞（receptor endocytosis），細胞周期，ERAD途徑或蛋白酶體降解的功能。比較泛素化修飾、K6位泛素化質譜結果，發現K6位泛素化蛋白是發生在VCP抑制後而不是蛋白酶體抑制後。作者採用泛素化位點替代的方法證實了K6位泛素化存在於ARL2，DCAF7，DNAJB2，HGS，和STAM2等蛋白中。

對pull down顯著富集的HECT-E3ligase HUWE1 knockdown，導致K6位泛素化修飾降低兩倍以上，證實HUWE1的確是主要作用於蛋白的K6位泛素化。

隨後，研究人員對泛素化修飾組學中鑒定到的VCP底物蛋白進行了分析。VCP被抑制後質譜鑒定分析鑒定了806個上調和636個下調的泛素化位點（P

圖3 泛素化修飾組學鑒定VCP底物

最後，研究人員挑選依賴於VCP蛋白酶體降解的底物c-Myc（K148）進行驗證。 VCP抑制處理後也同樣能增加外源表達的c-Myc，共聚焦顯微鏡觀察到內源的c-Myc表達水平上升主要定位在細胞核內。研究人員通過c-Myc-GFP進行 IP質譜鑒定了許多互作蛋白，如Max，VCP。在質譜鑒定的互作蛋白中，E3連接酶HUWE1被報道過調節c-Myc泛素化。研究人員隨後證實了VCP是從高度結構化的c-Myc-Max異源二聚體的染色質中提取出c-Myc並通過蛋白酶體降解，從而實現了對基因表達的調控 （圖4）。

圖4 VCP對轉錄因子c-Myc的調控。

C-Myc和Max二聚體結合到染色質，啟動基因表達。HUWE1對c-Myc的K148泛素化導致VCP結合，之後導致c-Myc的解離，進入蛋白降解途徑。

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小結

本研究採用SILAC技術和泛素化殘基對VCP抑制後進行了高通量的泛素化修飾丰度及位點鑒定。鑒定和定量到了806個上調和636個下調的泛素化位點。篩選到了456各VCP候選底物，功能主要涉及調控基因表達，DNA修復和細胞周期。通過與蛋白酶體抑制後的泛素化修飾比較，篩選到119個不依賴於蛋白酶體的調控途徑底物。發現VCP抑制後特異性增加的K6位泛素化修飾，主要是通過HECT型泛素化連接酶HUWE1識別。 證實了VCP通過新型的底物轉錄因子c-Myc調控細胞基因表達。

泛素化修飾組學能夠很好的解決泛素化很難使用底物特異性抗體去鑒別其修飾情況和修飾位點的難題，將VCP底物一網打盡，因此調控機制盡收眼底。

參考文獻：

1. Herdelberger J, et al. Proteomic frofiling of VCP substrates links VCP to K6-linked ubiquitylation and c-Myc function. EMBO Rep., 2018.

2. Ordureau A, et al. Defining roles of PARKIN and ubiquitin phosphorylation by PINK1 in mitochondrial quality control using a ubiquitin replacement strategy. Proc Natl Acad Sci USA, 2015.

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