新的細菌分類方法以及M.profundi D25從陸地轉移到海洋的轉移
關鍵詞：細菌分類方法、海洋細菌、從陸地到海洋的轉移
預計用時：10分鐘
導語
上一部分我們介紹了秦啟龍教授分享的《通過比較基因組學研究海洋細菌的分化、分類和適應》。
本期，我們將分享秦啟龍老師在大會所做的報告的第二部分：一個基於基因組分析的原核屬的分類方法和新型基因組進化和M. profundiD25從陸地向海洋過渡的異源物種形態。
專家介紹
秦啟龍教授工作于山東大學，所在團隊為微生物技術國家重點實驗室海洋生物技術研究團隊。
研究方向為海洋微生物生態學，利用組學技術和分析方法研究海洋微生物適應海洋特殊環境的方式和機制。
一個基於基因組分析原核屬的分類方法
近年來隨著高通量測序技術的飛速發展，細菌的基因組數據已經被廣泛應用於物種分類之中，然而還沒有原核生物屬水平上的分類標準 (Qinet al., 2014)。用於種水平上的分類方法，例如ANI(平均核酸同一性)，DDH(DNA-DNA雜交)，16S rRNA基因同一性等方法並不適用於細菌屬水平上的分類。因此秦啟龍教授所在團隊開發了一種新的分類方法-POCP(保守蛋白百分比)作為一個基於基因組分析的細菌屬水平上的分類方法 (Qinet al., 2014)。
首先，秦啟龍教授用數據證明ANI並不適用於原核生物屬水平上的分類。圖一展示了不同屬和同屬的成對基因組的ANI與16S rRNA基因同一性的關係。從圖一中我們可以看出，對於同屬內的物種間比較，ANI的變化比較明顯；而對於不同屬之間的ANI比較，ANI的值變化不明顯。這說明了原核生物屬間ANI值非常接近並且存在部分重疊，意味著在屬水平上ANI值的解析度太低 (Qinet al., 2014)。
除此之外，由於ANI計算演算法僅考慮高度相似的序列，當兩個菌株具有較遠的遺傳關係時(例如不同屬之間菌株的比較)，僅有一小部分的全基因組DNA 序列用於ANI計算，大部分DNA信息被捨棄 (Qinet al., 2014)。
綜合以上兩點，秦啟龍教授得出結論：ANI不適用於屬水平上的比較，不能用於我們目前數據的屬的劃分。
圖一：不同屬和同屬的成對基因組的ANI與16S rRNA基因同一性的關係 (Qinet al., 2014)。黑色三角形：不同屬之間的比較。紅色方框：同屬的不同物種間的比較。
保守蛋白百分比(POCP)被認為是蛋白質負責執行多功能細胞功能過程的基礎，此外，DNA序列中的核苷酸取代通常引起非同義氨基酸取代，其既不改變蛋白質功能也不改變菌株表型。因此，POCP值可能適合評估兩株菌的進化距離和表型差異 (Qinet al., 2014)。POCP的計算公式為 POCP = (C1+C2)/(T1+T2) * 100%，C1和C2分別為被比較的兩個菌株中保守蛋白的數量，T1和T2分別為被比較的兩個菌株中蛋白的總數，理論上來講，POCP的變化範圍為0-100% (Qinet al., 2014)。
接下來，秦啟龍教授使用展示在圖一中的同一批數據進行POCP的計算，結果如圖二所示 (Qinet al., 2014)。結果表明，來自於不同屬的兩個菌株的POCP值均勻地分布在很寬的區域，並且可以清楚地彼此分離。另一方面，相比於ANI的結果，重疊的部分也少了許多。這說明POCP是比ANI更好的屬水平上的分類方法。
圖二：不同屬和同屬的成對基因組的POCP與16S rRNA基因同一性的關係 (Qinet al., 2014)。黑色三角形：不同屬之間的比較。紅色方框：同屬的不同物種間的比較。
最後，秦啟龍教授總結了界定原核生物屬的POCP標準。概括為三條：1. 通常，可以將50％的POCP值作為屬邊界提出；2. 如果菌株屬於特定屬，則該菌株與同一屬的任何其他物種之間的POCP值應該高於該菌株與來自其他不同屬的任何物種之間的POCP值；3. 從基因組的角度來看，原核屬可以定義為所有成對POCP值高於50％的一組物種。
新型基因組進化和M. profundiD25從陸地向海洋過渡的異源物種形態摘要
每年都會有大量的細菌從陸地轉移到海洋，其中約有3-4 x 10的28次方個原核細胞通過河水的流動從陸地轉移到海洋。海洋和陸地之間顯著的細菌群落差異表明了絕大多數轉移的細菌是無法生存的。但是毫無疑問，仍有一些細菌存活了下來，例如在海水中已經檢測到人類病原體。
在本次報告中，秦啟龍教授介紹了名為M. profundiD25的海洋細菌，該菌屬於擬桿菌門，是從中國大陸附近的沖繩海槽南部的深海沉積物中分離出來的。它與人類病原菌Myroides odoratimimus有著很高的基因組序列同一性。最後秦啟龍教授以該菌為代表探究了從陸地向海洋轉移的細菌是如何適應新的海洋環境的。
M. profundiD25T從陸地轉移到海洋
沖繩海槽南部與長江口相鄰，是東海大陸架有機質的重要沉積中心。M. profundiD25即是從這裡分離出來的 (Zhanget al., 2016)。每年都有大量的有機物質，包括細菌生物質通過長江被沖入海中，最後沉積在沖繩海槽 (Kaoet al., 2003)。目前香味菌屬(Myroides)有8個從不同環境分離出的物種，根據這8個物種的16S rRNA基因系統發育分析的結果(如圖三A所示)，與M. profundiD25親緣關係最近的物種是人類病原菌的Myroidesodoratimimus，與M. profundiD25具有第二相近親緣關係的菌種M. xuanwuensis是在長江附近的森林土壤中被分離出來的 (Zhanget al., 2014)。M. profundiD25的兩個親緣關係最近的物種都來源於陸地環境，根據簡約原理，這三種菌的共同祖先應該是生活在陸地之中，並推測出M. profundi D25是經過長江被沖入到海洋之中最後沉積在沖繩海槽中 (Zhanget al., 2016)。此外由於M. profundiD25和Myroides odoratimimus之間有99.2%的16S rRNA基因一致性，可以推測出M. profundiD25應該是不久之前才分化出來的。這使得M. profundiD25可以成為研究細菌早期基因組進化的良好菌種 (Zhanget al., 2016)。
圖三：M. profundiD25的系統發育和生理特徵 (Zhanget al., 2016)。(A)香味菌屬8個物種的關係和分類的位置。(B)在不同程度稀釋的海水樣品製備的培養基中培養的M. profundiD25的生長曲線。
區分陸地環境和海洋環境的一個主要環境因子是鹽度 (Lozupone and Knight, 2007)。目前所有已確定的香味菌屬的物種均可在沒有氯化鈉的條件下存活，這說明了香味菌屬的祖先生存在低鹽度的環境中 (Zhanget al., 2016)。
為了進一步探究M. profundiD25的最適宜生存的鹽度，秦啟龍教授觀察了M. profundiD25在不同鹽度條件下生長的情況，結果如圖三B所示。從圖中可以看出，最適宜的鹽度為0.9%(1/4 x 海水的鹽度)，表明該菌並不是完全適應高鹽的條件。雖然0.9%是其最適合生長的鹽度，但是在3.5%的鹽度下(海水鹽度)，該菌生長狀況仍然很好。根據之前的研究，從海洋環境中分離出來的香味菌屬物種要比從陸地環境中分離出來的香味菌屬物種更耐高鹽 (Tomovaet al., 2013)。
此外，M. profundiD25是從寒冷的深海環境中分離出來的，可在低溫(4℃)下生長。高鹽耐受性和低溫生長能力表明，M. profundiD25確實可以生活在海洋環境中 (Zhanget al., 2016)。
全基因組比較
接下來，秦啟龍教授對M. profundiD25以及與它親緣關係最近的物種M. odoratimimusCCUG 39352T進行了全基因組測序並比較。比較結果如圖四所示。
從圖中我們可以看出，兩個基因組具有相同的GC含量和非常相似的基因組大小；兩個基因組之間的平均核苷酸同一性(ANI)為94％，表明這兩個物種之間的遺傳相關性較高。這與16S rRNA基因分析一致。
除此之外，這兩個菌株還表現出較高的基因組線性。總體而言，這兩個基因組沒有顯示其他重大的基因組重排，表明這兩個物種是最近才從共同祖先中分化出來。
圖四：M. profundiD25和M. odoratimimusCCUG 39352T的基因組特徵 (Zhanget al., 2016)
迅速和緩慢進化直系同源蛋白質的功能
M. profundiD25T和M. odoratimimusCCUG 39352T共有2991個直系同源蛋白，分別佔兩個基因組全部蛋白的84%和81%，在這2991個蛋白中，81%(2428個蛋白)具有超過95%的序列相似性。這更加證明了這兩個菌株具有緊密聯繫的觀點 (Zhanget al., 2016)。
秦啟龍教授還發現兩個蛋白質編碼基因之間的蛋白質序列同一性和每個位點的非同義替換率(Ka)顯示出良好的線性關係，結果如圖五(A)所示。根據這個圖，秦啟龍教授將直系同源蛋白分成兩組，第一組為同一性大於95%，Ka值小於0.02的蛋白，共包括了2300個蛋白質，可以被認為是緩慢進化的蛋白質，並且功能應該是保守的。根據COGs的功能分析結果(圖五B)，我們可以看出，這些蛋白在能量產生，氨基酸代謝和翻譯功能上有著較高的比例。
這與預想的一致，因為這些功能都是非常基本並且保守的。另外一組包含剩餘的691個直系同源蛋白，被認為是快速進化的蛋白質，因為它們在相同的進化時期內積累了比慢速進化的蛋白質更多的非同義替換。快速進化蛋白在轉錄，信號轉導和DNA重組和修復的功能上具有較大的比例。水平基因轉移(HGT)在自然界普遍存在，並且可以對細菌生態位擴大作出重大貢獻。成功的HGT需要將外源DNA整合到基因組中，在這個過程中DNA重組和修復系統發揮重要作用 (Thomas and Nielson, 2005)。在M. profundiD25中，與DNA重組和修復功能相關的蛋白被分到了快速進化蛋白中，這導致了M. profundiD25通過HGT獲得新基因的能力增加。這將有助於M. profundiD25獲得新的生理特性以適應新的環境。行使轉錄功能的蛋白大多屬於快速進化蛋白，表明該菌株在適應性早期傾向於重塑基因調控網路以適應新的環境。信號轉導相關蛋白也發生了很快的變化。這表明，在海洋環境中，M. profundiD25適應於改變信號轉導系統以響應不同的信號分子。信號轉導蛋白和轉錄調節因子的進化可賦予M. profundiD25在改變周圍條件下快速改變表型的潛力 (Zhanget al., 2016)。
圖五：M. profundiD25和M. odoratimimusCCUG 39352T的直系同源蛋白的分析。(A)蛋白質序列同一性和蛋白質編碼基因的每個位點非同義替換率(Ka)之間的關係。(B)比較快速和緩慢進化的直系同源蛋白質的鑒定的COG功能。星號表示功能類別的百分比在統計學上顯著不同(P et al., 2016)。
M. profundiD25T中獨特的基因來源和功能
M. profundiD25和M. odoratimimusCCUG 39352T分別具有557和723種獨有的基因，將這些基因與Myroides中其他菌的基因組比較，未比上的基因分別為227和133個，這些基因被認為是真正獨有的基因。
獨有基因的數量遠低於其他研究報道的數量 (Nowellet al., 2014; Qinet al., 2014)。這些數據也支持了這兩個物種近期才分離的概念，因為只有少數外源基因積累在基因組中。M. profundiD25中具有更多的獨有基因也證實了M. profundiD25在分離後面臨了新的環境。由於該227個基因在Myroides屬內沒有直系同源，因此這些基因是通過HGT獲得其他屬的基因。其中92個基因可以檢測到基因的來源，並鑒定出供體的物種分類信息，結果如圖六所示。
從圖中可以看出，這些基因來自於6個門類，其中擬桿菌門貢獻最多（~59%）。許多推定的供體物種都與海洋和動物棲息地有關。有趣的是，有三個基因來自藍藻的淡水物種的供體。這意味著深M. profundiD25的直系祖先可能已經在淡水中生存了一段時間，這與通過河流將該菌轉移到海洋的預測是一致的。此外有135個獨特的基因沒有可識別的供體，這表明許多這些基因來源不明，其功能尚不清楚 (Zhanget al., 2016)。
圖六：在門水平獨特的基因的推定來源 (Zhanget al., 2016)。
M. profundiD25T對高鹽的適應
上文提到過鹽度是海洋環境和陸地環境的主要差別。因此秦啟龍教授想要探究M. profundiD25是如何適應高鹽環境的。主要是研究了M. profundiD25中差異表達的基因，以調查哪些基因與高鹽適應有關。COG功能比較表明，上調的基因編碼參與轉錄和無機離子轉運和代謝的蛋白比例較高，結果如圖七所示。這可能表明M. profundiD25改變了轉錄以產生更多的離子轉運子以對抗高鹽度脅迫 (Zhanget al., 2016)。在這些上調基因中，有49個基因上調的量超過了4倍，上調倍數最大的基因是MPR_3295，其編碼三甲基胺單加氧酶，功能是將三甲基胺氧化成三甲基胺氧化物(TMAO) (Chenet al., 2011)。TMAO是海洋生物中常見的有機相容滲透劑，可以幫助維持細胞滲透平衡 (Yanceyet al., 2014; Gohet al., 2010)。在高鹽度條件下MPR_3295基因顯著上調的事實表明，M. profundiD25可能積累TMAO以調節其細胞滲透平衡 (Zhanget al., 2016)。
圖七：在高鹽度條件下生長的上調和下調基因的COG功能的比較。星號表示該類別的百分比在統計學上顯著不同（P et al., 2016)。
值得注意的是，在49個上調量超過了4倍的基因中，沒有任何一個基因被鑒定為獨特基因或可能最近獲得的基因。RPKM（每百萬個基因組讀取每千鹼基對外顯子模型）結果也支持這個結論。PKM值可以被看作是比較不同條件下基因表達水平的指標。在高鹽條件下，獨特基因的平均和中值RPKM值分別為75和37，而總檢測基因的平均和中值RPKM值分別為320和92，如圖八A所示。M. profundiD25中獨有基因的GC含量顯著低於其他基因，如圖八B所示。
這可以解釋為什麼這些基因的表達水平要明顯低於Myroides屬核心基因的表達水平。此外，通過HGT獲得的獨有基因可能不會被整合到宿主的調控網路中，導致其在某些條件下表達水平低。在高鹽度條件下，這些基因表現出相對較低的表達水平並且其表達水平被最小程度地調節。這表明M. profundiD25中獨有的基因不太重要，對早期分化時期的新生態位適應性貢獻不大。垂體遺傳基因和基因表達系統的重構對M. profundiD25在高鹽度環境中的適應更為重要 (Zhanget al., 2016)。
圖八：M. profundiD25的全部基因和獨有基因的RPKM和GC含量分析。（A）在高鹽度條件下測定的M. profundiD25生長的RPKM值 （B）獨有基因和全部基因的GC含量分布。點代表對應於x軸數目±0.5的GC含量區域的百分比 (Zhanget al., 2016)。
對細菌異種形態的影響
M. profundiD25的形態可以被認為是一種細菌異源物種形成過程。在新生物種形成階段，遺傳基因的調控在新的環境中對物種的生存起主要作用。然後，現有基因的突變有助於物種的形成過程。
秦啟龍教授的研究結果顯示不同的基因有不同的進化速度。通過HGT獲得的基因可能加速異源物種形成。在新的海洋環境中，M. profundiD25將有機會與周圍的海洋細菌進行DNA交換。這將增加了M. profundiD25與其陸生親緣之間的遺傳距離，導致出現一個新的物種。考慮到從陸地向海洋轉移的大量細菌，可以想像陸生細菌的異源物種形成對海洋細菌群落的多樣性有很大貢獻 (Zhanget al., 2016)。
結 論
當M. profundiD25從陸地轉移到海洋，它面對了新的環境，基因組必須進化以適應不同的環境。在適應過程中，主要通過調節核心基因的表達來使細菌存活。對於細菌來說，HGT在獲得新能力和適應不同微生境的潛力方面起著關鍵作用 (Shapiroet al., 2012; Kleineret al., 2012)。然而，在這項研究中，HGT對細菌適應新環境做出的貢獻並不大。相反，垂直遺傳基因發揮著更重要的作用 (Zhanget al., 2016)。但是HGT基因可能在長期適應中起重要作用。
最後人類的生理鹽度為0.9%，病原體可以適應這個鹽度，除此之外，它們還可以適應像海洋環境的高鹽度。在其他實驗進化研究中也觀察到類似的現象 (Gonzalez and Bell, 2013; Ketola and Hiltunen, 2014)。這對海洋環境中的公共衛生，特別是在沿海地區，具有重要意義。
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