王初課題組發展可鑒定鐵死亡過程中蛋白羰基化修飾的苯胺探針
近日，北京大學化學與分子工程學院王初課題組在Journal of American Chemical Society雜誌上發表題為「Quantitative profiling of protein carbonylations in ferroptosis by an aniline-derived probe」的研究文章(DOI: 10.1021/jacs.8b01462)。本文同時被選為"ACS Editors" Choice"和「JACS Spotlights」文章。
鐵死亡(ferroptosis)是在2012年被注釋的一種新的細胞死亡方式，它在細胞形態學、生化特徵以及基因水平上都與凋亡、壞死、自噬等傳統的細胞死亡方式具有顯著的差別。鐵死亡有兩個顯著特徵：死亡過程依賴鐵元素和細胞內的活性氧物種（ROS）水平升高。目前常用的兩種鐵死亡誘導劑是RSL3和erastin，它們可以通過直接或間接的方式抑制谷胱甘肽過氧化物酶（GPX4）的活性，從而抑制細胞清除脂質過氧化物的能力，導致ROS不斷累積，引發細胞死亡。
而當細胞內發生脂質過氧化時，細胞膜、線粒體膜、內質網膜等結構中的多不飽和脂肪酸（PUFA）會發生降解生成脂源性親電小分子（lipid-derived electrophiles，簡稱LDEs ）。這些小分子大多具有α, β-不飽和醛或酮的結構，可以與蛋白的親核性殘基Cys, His和 Lys發生Michael加成反應形成羰基化修飾，從而影響蛋白的結構和活性。到目前為止，羰基化修飾已被報道與神經退行性疾病、糖尿病、心血管疾病等多種病理條件密切相關，因此羰基化修飾蛋白和位點的鑒定對於理解相關疾病的發生具有重大意義 (Curr Opin Chem Biol 2016,30, 37-45)。
在此之前，王初課題組發展了生物正交的羥胺探針，以經典的LDE分子4-羥基壬烯醛（HNE）為模型，結合還原性二甲基化標記技術，在體外實現了對羰基化修飾蛋白和位點進行了直接的大規模捕獲和鑒定 (Redox Biol 2017,12, 712-718)。
然而鑒定病理條件下內源性LDEs的修飾蛋白及位點仍是該領域的重大挑戰。為了解決這一難題，王初課題組首次將廣泛應用於oxime ligation中的催化劑苯胺結構引入到化學蛋白質組學中，以HNE為模型分子，建立了蛋白羰基化修飾的定量化學蛋白質組平台，並首次通過直接的方式對超過1000個Cys的反應活性進行了定量研究。苯胺探針具有以下優點：首先這是一種商業化的化合物，廉價易得；其次與經典的醯肼、羥胺類探針相比，具有更高的靈敏性，非常適合研究信號微弱的內源性羰基化修飾；最為重要的是，苯胺探針與肽段的加成物的化學性質十分穩定，可以避免質譜制樣和上機過程中發生碎裂。
作者將該探針應用於檢測細胞鐵死亡過程中蛋白羰基化修飾。結合還原性二甲基化標記策略，鑒定出超過400個在鐵死亡中發生羰基化修飾的蛋白。功能性分析顯示這些蛋白主要定位在內質網、高爾基體、線粒體等富含多不飽和脂肪酸的細胞器中，並且富集到肺癌、腎損傷和HIV等疾病中。這是首次對細胞鐵死亡中的羰基化修飾進行蛋白質組學的研究，這些成果為後續深入的機理探討奠定了堅實基礎。
進一步地，結合TOP-ABPP技術，利用酸切割標籤，作者成功地鑒定到了鐵死亡過程中內源產生的8個HNE、11個ACR以及5個ONE修飾位點。與此同時，作者對線粒體外膜蛋白VDAC2的第210位半胱氨酸上的修飾進行了生化驗證，而細胞活力實驗結果顯示該位點在細胞發生鐵死亡時可能發揮著清除LDEs的重要功能。
本文通訊作者為北京大學化學與分子工程學院的王初特聘研究員，第一作者為王初課題組四年級博士研究生陳影，王初課題組博士後劉源，本科生藍童、研究生秦為等多位同學為本課題的完成提供了幫助，德國慕尼黑Helmholtz研究所的Marcus Conrad教授等也參與了本課題的合作。
引用：
Chen, Y., Qin, W., and Wang, C. (2016). Chemoproteomic profiling of protein modifications by lipid-derived electrophiles. Curr Opin Chem Biol 30, 37-45.
Chen, Y., Cong, Y., Quan, B., Lan, T., Chu, X., Ye, Z., Hou, X., and Wang, C. (2017). Chemoproteomic profiling of targets of lipid-derived electrophiles by bioorthogonal aminooxy probe. Redox Biol 12, 712-718.
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