ctDNA可靠性又遭質疑？一文助你真正理解ASCO＆CAP聯合綜述
編者按
近日，美國臨床腫瘤學會(ASCO)和美國病理學家協會(CAP)共同發表了一項聯合綜述，針對實體腫瘤ctDNA測序的臨床有效性和實用性進行討論。在液體活檢技術飛速發展的關鍵節點，ASCO和CAP的這一舉動旨在通過對現有證據的分析，規劃腫瘤ctDNA檢測的臨床實踐和未來研究的方向和框架，指引這一有能力推動腫瘤醫學不斷進步的檢測方法更好地服務臨床。
然而，多篇國內評論文章卻就此事直指液體活檢再次遭遇尷尬，前路迷惘；這不禁令人回想起2017年底一則JAMA子刊的發文, 如只看結論本身，提示美國兩家頂尖基因檢測公司為同一批癌症患者做了液體活檢，結果大相徑庭，但仔細分析其中原因，會發現這一差異並不緣於兩家公司的檢測平台均不可靠，而可能只是其中一家出現質量失控造成的極大差異。（點此閱讀燃石醫學此前的深入解讀文章）
ACSO與CAP聯合對於液體活檢的討論，究竟是在質疑ctDNA檢測路在何方？還是更加篤定地指明了前進的方向？燃石醫學請來醫學專家為您深入解讀。（完整閱讀本文需要約3分鐘，但乾貨滿滿，非常值得一讀）
文章回顧
循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA ctDNA）檢測，憑藉其無創、快速、全面等特點，被認為是能夠克服組織標本局限性的理想選擇在近年備受關注。此次評估最終納入2007-2017年發表的77篇相關研究，關注的內容包括：ctDNA檢測的可靠性和準確性；ctDNA是否可預測患者臨床治療的效果；ctDNA監測能否改善患者臨床結局；以及其在癌症普篩的現狀。
主要結論如下：
一些ctDNA檢測對某些類型晚期癌症的臨床有效性和實用性已被證實;
目前大多數ctDNA檢測還缺乏足夠的臨床試驗數據表明其臨床有效性和實用性；在晚期癌症患者中，ctDNA檢測結果與腫瘤組織樣本檢測結果並不完全一致；
ctDNA檢測對早期癌症的治療療效或殘留疾病監控，目前還沒有足夠的臨床實用性和有效性方面的證據；
目前還沒有臨床試驗數據證據表明ctDNA可用於癌症普篩；
鑒於研究的快速進展，基於此類對文獻和數據的綜合評估將會快速更新。
其實，本文中ASCO和CAP的科學家們在總結現狀，提出問題的同時，已經明確指出了針對目前較為混亂的液體活檢市場，ctDNA檢測之路該如何規範前行：
下面劃重點
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ctDNA檢測本身該如何規範？
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質控！質控！質控！
從收取樣本、運輸，到DNA提取、上機檢測，這一系列流程的操作都有可能影響最終檢測結果的準確與否。ctDNA檢測作為一項新入臨床的技術，與任何臨床檢測一樣，在檢測前階段就應盡量避免影響事件，必須在有規範的SOP，並在取得權威資質認證的實驗室進行。
截至目前，燃石醫學已經獲得包括EMQN、NCCL、PQCC等家權威機構頒發的30餘項室間質評認證；也是中國唯一符合NCCN指南要求的通過美國CLIA認證的NGS臨床檢驗所；並且已獲得CFDA發出的首張基於Illumina測序平台腫瘤應用方向NGS檢測產品的《醫療器械註冊申請受理通知書》。
同時，燃石一直積極倡導ctDNA檢測質控規範化。截止目前，燃石是國內唯一一家在每一份臨檢報告中詳細給出樣本質量評估的公司（如下圖），針對血檢的質控內容包括：測序前的DNA質量（DNA總量，片段降解程度，預文庫總量）和測序質量評估。針對在測序前就發現的警戒或者不合格的樣本，會及時與醫生和患者溝通，盡量將檢測前事件的影響降到最低。
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看似無章可尋的液體活檢其實亂中有序
JCO文中明確指出：不同的檢測平台/方法，即使包括的基因和基因數目相似，但實際檢測的內容還是千差萬別，大家往往忽略的是每個基因真正覆蓋的檢測區域，還有有效檢測深度是多少，而這些因素在液體活檢非常重要，往往直接關乎是否能檢測到直接與治療指導、療效評估相關的目標基因。而當覆蓋範圍和測序深度不同，即使對於同一患者的同一樣本，檢測結果往往大相徑庭。正如之前提到的JAMA Oncology的文章，但這並不代表所有的檢測技術均存在問題。
臨床實際中針對不同的臨床場景，所設計的檢測也確實也不可能完全一致，例如癌症早期和晚期患者的血檢、腦轉移患者腦脊液和外周血的檢測、體系變異和胚系變異的檢測等，所必需的檢測深度就不一樣。
但看似無章可尋的液體活檢其實是亂中有序的，例如針對晚期癌症患者，在所有ctDNA突變中16.1%的突變丰度均在0.5%以下（基於燃石內部數據，如下圖），這意味著只有有效檢測深度達到4000-5000X才能有效捕獲這些低丰度變異，而降噪技術是正確辨識低頻突變的重中之重。
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客觀、科學地分析血液與組織檢測的差異性
JCO文中特彆強調：對於檢測下限和低丰度突變需要仔細分析，推薦與配對組織結果對比來驗證ctDNA檢測有效性。但基於腫瘤組織空間異質性等問題，追求血檢與組織檢測結果100%的一致性是不符合腫瘤生物學行為和臨床實際的。所以，我們需要客觀、科學地分析血液與組織檢測的差異性。
總結已有數據，在晚期NSCLC中針對EGFR的組織和血漿檢測，國際領先的檢測平台的一致性波動於70-90%之間。
燃石醫學在上海胸科醫院的單中心驗證項目中，燃石朗清?在一線晚期NSCLC患者中ctDNA檢測敏感性整體達87.2%，其中主要驅動基因的敏感性達96.2%（與配對組織對比），在與國際同行比較中，血檢敏感和特異性均處於領先水平。針對晚期癌症患者，燃石堅持平均超過10000X的深度測序，通過燃石自研的HS優化建庫流程（已獲國家專利），將有效測序深度提升至平均超過5000X，有效覆蓋晚期腫瘤患者血液中的低丰度突變。
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跨平台交叉對比是新興技術結果驗證的試金石
JCO的評論中大力倡導，建議開展更多大型多平台交叉驗證來進一步規範ctDNA檢測。
2017年WCLC公布的ADELOS研究中，採用4個不同的檢測平台（cobas、super-ARMS、NGS和ddPCR，其中NGS採用燃石技術），檢測患者血漿ctDNA T790M突變狀態。在前期數據中，4種方法檢測T790M陽性率依次為37%、42%、54%、64%。以cobas作為參考，NGS的敏感性最高，達99%；而ddPCR法的特異性和一致性較低，分別為52%和67%。以組織作為對照，NGS血檢敏感性和一致性最高（均超過70%）。目前，血漿檢出T790M突變陽性的患者正在接受奧希替尼治療，期待後續研究結果，這一前瞻性研究結果將驗證採用血漿篩選患者的臨床意義。
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如何對測序結果提供專業規範的解讀？
即使通過檢測獲得了質量較高的原始數據，如何解讀這些數據也非常重要。將原始的檢測數據轉化為與臨床治療指導相關的信息還需要大量專業和規範的分析解讀工作。
例如，在臨床實踐中，腫瘤生長的部位不同，可能釋放入血的能力也不盡相同。JCO文章特別提出了針對中樞神經系統腫瘤的患者，如何解讀血檢陽性率低的結果？
其實這一現象早就被研究者們關注，2015年NatureCommunication已發表研究，在外周血ctDNA幾乎全軍覆沒的對比下，在腦脊液ctDNA中有效檢出主要驅動變異，且腦脊液反映的突變丰度與疾病的進展緊密吻合。2018年1月，燃石醫學與廣東省人民醫院合作的研究在Ann Oncol發表，在腦膜轉移的EGFR突變型NSCLC患者中，驅動基因突變在100%的腦脊液上清樣本、84.6%的腦脊液沉渣樣本、73.1%的血液cfDNA樣本中被檢出，且92.3%的患者在腦脊液上清中顯示更高的腫瘤突變丰度，再次印證了腦脊液上清是反映腦膜轉移突變全景的最佳取材。
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如何轉化為臨床實際獲益？
一大波臨床試驗數據正在路上……
雖然基於目前的臨床試驗數據，在大部分臨床實踐中，組織仍是腫瘤基因檢測的首選，但組織標本取材困難、處理複雜以及標本異質性等都對臨床檢測產生了一定的局限性，特別是晚期以及耐葯後進展的患者，組織可及性和腫瘤的空間異質性明顯成為這一人群再次獲得用藥機會的阻礙，液體活檢尤其是ctDNA檢測的確是突破這些限制的理想之選。
對腫瘤患者而言，評估ctDNA準確性最可靠的策略是進行前瞻性臨床試驗。
雖然目前此類研究數據尚缺乏，值得一提的是ctDNA測序技術真正在臨床開展才3年左右，2014年5月，美國Stanford大學實驗室的Newman等在Nature medincine發表了利用CAPP-Seq針對肺癌進行的ctDNA檢測，展望了這一技術可常規應用於惡性腫瘤的臨床檢測並將促進癌症的個體化檢測，治療和監控。
3年來，全球的科學家們積極推動著ctDNA技術的進步，直到近兩年才有研究開始回顧性納入ctDNA作為分析指標。2017 ASCO會議上已有數十篇基於ctDNA檢測結果反映腫瘤複發風險或療效預測的回溯性研究（包括肺癌，腸癌、食管癌，乳腺癌，膀胱癌等惡性腫瘤）被報道，並且均取得顯著性相關的結果。在深受關注的免疫治療上，也看到了基於ctDNA檢測反映的bTMB（Tumor mutation burden in blood）與atezolizumab療效相關的Ⅱ-Ⅲ期研究結果(POPLAR AND OAK，2017 ESMO)。
第一個基於ctDNA前瞻性入組的研究BENEFIT，其數據已經在2017 WCLC公布（該單臂研究是基於ddPCR血檢EGFR突變入組患者），其中基於基線NGS血檢（燃石朗清?）的結果，將EGFR敏感突變患者進行了進一步分層，合併其他驅動突變患者的PFS較EGFR單突變患者縮短7.7月（5.5m vs.13.2m）。
在JCO報道中，ASCO和CAP積極倡導將ctDNA檢測用於前瞻性臨床研究，建議未來開展ctDNA檢測臨床有效性的驗證實驗時，應包括盡量接近預期使用人群的患者隊列，樣本需從明確定義入組標準的前瞻性研究中採集。
從Clinical Trail官網註冊研究的數目來看，關於ctDNA的臨床研究，2015-2016共啟動了87項研究，2016至今又有130項研究開展，仔細查閱這些研究，絕大部分均處於Recruiting（招募）或數據收集整理階段，也就是為什麼確實目前已發表的來源於前瞻性臨床研究的數據並不多的原因。
但是，從研究的數量和遞增的趨勢我們可以預估，就在今年或者明年，將會有大批的臨床研究數據證實，某些ctDNA檢測的準確性和臨床實用性，這些數據也將約束並且規範ctDNA檢測的發展方向，從井噴式地、大面積橫向鋪展，轉變成向少數規範且經得起嚴格評估的檢測平台和實驗室立體提升，為臨床服務。
參考文獻：
Merker JD, Oxnard GR, Compton C, et al. Circulating Tumor DNA Analysis in Patients With Cancer: American Society of Clinical Oncology and College of American Pathologists Joint Review. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology. 2018:JCO2017768671.
Torga G, Pienta KJ. Patient-Paired Sample Congruence Between 2 Commercial Liquid Biopsy Tests. JAMA Oncol. 2017.
Mao X, Zhang Z, Zheng X, et al. Capture-Based Targeted Ultradeep Sequencing in Paired Tissue and Plasma Samples Demonstrates Differential Subclonal ctDNA-Releasing Capability in Advanced Lung Cancer. Journal of thoracic oncology : official publication of the International Association for the Study of Lung Cancer. 2017;12(4):663-672.
Newman AM, Bratman SV, To J, et al. An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage. Nature medicine. 2014;20(5):548-554.
燃石醫學成立於2014年，專註於為腫瘤精準醫療提供最具臨床價值的精準二代基因檢測（NGS），針對不同癌種和不同臨床階段的20餘種檢測產品涉及腫瘤良惡性檢測、腫瘤靶向用藥伴隨檢測、腫瘤複發監控及腫瘤遺傳檢測。
燃石醫學擁有中國第一間獲得美國CLIA認證的ctDNA和腫瘤組織二代測序臨床檢測實驗室，公司與全國各省400多家頂尖醫院廣泛開展合作，並累積有中國最大肺癌基因組資料庫。
此外，燃石醫學提供一站式NGS平台解決方案，致力於推進NGS檢測落地醫院病理科，惠及更多腫瘤患者。目前，燃石是首個通過國家食品藥品監督管理總局（CFDA）審核進入《創新醫療器械特別審批程序》的腫瘤應用方向NGS公司，更已於近期獲得CFDA發出的首張基於Illumina測序平台腫瘤應用方向NGS檢測產品的《醫療器械註冊申請受理通知書》。
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