韓方普研究組在 CRISPR-Cas9 玉米基因組編輯方法研究中取得新進展

基因組編輯是生命科學新興的技術並被迅速在每個實驗室應用，特別是基於 CRISPR-Cas9 系統的基因編輯工具近年來發展較快，在醫療、農業等領域展現巨大的應用潛力。然而此前，在玉米等部分作物中基於農桿菌轉化的載體進行基因組編輯的效率偏低，在一定程度影響到該技術的高效利用尤其是基於 CRISPR-cas9 系統的高通量突變 allele 篩選。因此，如何提高編輯效率是大家關注的問題。另一個非常關鍵的問題是如何降低脫靶或不脫靶，這也是實際應用的限制因素。

中國科學院遺傳與發育生物學研究所韓方普實驗室前期選擇了若干玉米減數分裂特異基因的啟動子用於驅動 Cas9 基因的表達，希望在配子中實現高效的基因組編輯，從而在 T1 代獲得大量純合或雙等位的突變體。其中用到的一個為玉米 DMC1 基因啟動子，構建了 DPC（DMC1 promoter-controlled） CRISPR-Cas9 載體系統，用該載體系統轉化玉米幼胚後，結果意外發現：凡是抗性愈傷組織靶位點均發生基因組編輯，另一個非常有趣的結果是：T0 代植株中出現 60-70% 左右的純合或雙等位的突變體，其餘為雜合或嵌合的突變體植株。並且這些純合或雙等位突變體植株 (再生自一個抗性愈傷組織) 含有不同的突變 allele 類型。通過對多個基因靶點（包括一個標記基因 zb7，突變能產生白化的表型）的編輯實驗，驗證了該載體系統的高效性（下圖為對玉米 zb7 基因靶點的編輯）。這一技術對韓方普研究組研究細胞分裂突變體的基因功能提供了非常快速高效的方法，當代純合或嵌合突變體就可以直接觀察細胞學及染色體行為與功能。此外，也證實了產生的突變能夠穩定遺傳到 T1 代，並且新的突變 allele 類型在 T1 代也被發現。通過全基因組測序分析，在預測的 1000 多個潛在脫靶位點沒有發現脫靶突變。由於 DMC1 基因在進化中非常保守，該基因的啟動子也可能有潛力在別的植物中發揮類似的作用，雖然科學家在小麥中的初步嘗試結果不甚理想。

該研究成果於 2018 年 3 月 23 日在線發表於 Plant Biotechnology Journal 雜誌上（DOI:10.1111/pbi.12920）。韓方普研究組博士生馮超為該論文的第一作者，該研究得到轉基因重大專項及科技部育種專項的資助。

圖：利用 DPC CRISPR/Cas9 系統編輯玉米 zb7 基因

A. zb7 基因結構、靶位點和 DPC CRISPR/Cas9 載體模式圖； B. 編輯 zb7 基因獲得的 T0 代植株表型； C. 部分 T0 代突變植株基因型鑒定的結果。

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