未來可期！納米孔測序技術幫助發現致病性結構變異，助力罕見病臨床診斷！

染色體複雜結構變異（cxSV）包含多個結構變體的基因組重排，它們對人類基因組變異有很大影響，並可能導致孟德爾疾病，但是由於基因測序技術的限制，通常會在臨床基因檢測中忽略它們。但隨著高通量測序的快速發展，NGS技術已經能夠實現高精度測序，有助於研究更複雜形式的SV，而長讀長測序技術的開發使科學家能夠獲得更長讀長的序列，結合生物信息學，進而獲得更豐富的基因信息，幫助尋找更多的致病基因，也使cxSV的致病機理研究成為可能。

近日，來自劍橋大學醫院NHS基金會信託基金及其合作單位的研究人員報告了一項最新研究成果，研究人員使用納米孔測序等不同測序方法，分析了1324名未確診的罕見病患者的cxSV，發現cxSV位點會對評估潛在致病基因產生重要影響，並且研究人員利用納米孔測序幫助一位罕見病患者確定了SV致病機理，該研究已發表於BioRxiv預印本中。

該研究的高級作者之一、劍橋大學研究助理Keren Carss表示，在過去的一年中，她的研究小組對染色體結構變異（SV）的致病機理越來越感興趣，並且在尋找與已知疾病基因重疊的結構變異過程中，意外發現了一個奇怪的SV，該SV由同一區域的兩個重複和一個反轉序列組成，這一發現激起了我們的研究熱情，我們想要系統地研究這個問題，以了解它導致的疾病在我們的病人中有多普遍。

研究人員分析了英國國立衛生研究院（NIHR）的生物資源，囊括了來自常見病和罕見病患者以及健康志願者的DNA樣本，研究人員還對未診斷的罕見病患者進行了短讀長全基因組測序，其中包括來自三個項目的患者樣本，分別為遺傳性視網膜疾病項目的725個樣本，神經和發育障礙項目的472個樣本以及Next Generation Children項目的127個樣本。

在從短讀長測序中調用結構變體數據後，他們通過聚類相鄰SV用於鑒定疾病相關基因中可能的複雜結構變體（cxSV），確定了81個疾病相關基因中可能存在的候選cxSV，在手動評估並重建其可能的結構體系後，研究人員將數量削減到46個，但他們發現這其中的42例並不太可能致病，因為患者表型與被破壞的基因不一致，或者患者在隱性疾病中為雜合子。

圖：全基因組測序鑒定的四種cxSV

A：Coffin-Siris 綜合征，B：癲癇、智力障礙，C：錐細胞營養不良，D：新生兒缺氧缺血性腦病

對於疑似與臨床相關的四例cxSV，研究小組使用Sanger測序確認了預測的新位點，並確定了預測的拷貝數變化和純合區域的微陣列，發現四例均為攜帶影響孟德爾疾病相關基因的cxSV個體，其中三例cxSVs是致病性的，分別引發了Coffin-Siris綜合征、智力障礙、癲癇等罕見病。

此外，研究人員在分析一名新生兒缺氧缺血性腦病患者的全基因組測序數據時，發現在他的X染色體上存在與CDKL5基因重疊的重複伴性反轉SV。同時，短讀長測序數據為該cxSV提供了兩種可能的體系結構，一種是CDKL5的第二個拷貝是完整的，另一個是CDKL5的第二個拷貝被破壞了。由於單獨的Sanger測序無法證實任何結構模型，因此研究人員將目光投向了納米孔測序，該測序方法能夠覆蓋所有的位點，並證實了CDKL5完整拷貝的存在，進而證明了SV與罕見病的遺傳關聯，鑒於複雜SV可能會影響基因調控，研究人員最終將其稱為意義未明的基因變異。

儘管該研究中僅有0.3％的患者被發現存在可能與疾病相關的複雜SV，但Carss認為由於研究評估具有保守性，所以實際臨床中可能更多，因為可能有些患者會被陣列發現具有拷貝數變異，但事實上他們是攜帶cxSV，除非做了更詳細的研究分析，否則你可能不會發現它。「雖然此前我們並不認為這種變異會導致很多孟德爾疾病，但我們的研究結果顯示cxSV是孟德爾疾病的一個重要但罕見的原因，因此建議在研究和臨床研究中考慮這一點。

Carss表示，其他團隊使用不同的方法分析cxSV，儘管短讀取測序技術能夠為重複區域提供更好的解析度，但卻將讀取長度限定在5000bp左右，而將其與納米孔測序結合就能避免這一弊端。

業內其他科研人員對這項研究表示了肯定，稱該研究證實了罕見的結構變異和拷貝數變異作為罕見疾病的原因。荷蘭Radboud大學醫學中心免疫基因組學教授Alexander Hoischen表示，這項研究證明一些SVs / CNV遠比我們最初想像的更加複雜，同時該研究也成為敦促研究人員使用長讀長測序技術，如Oxford Nanopore Technologies或Pacific Biosciences，幫助診斷一些罕見病例。他表示，目前他的研究團隊也正在該測序技術的幫助下系統研究罕見病，且已經確定了總共23000個SV和30000個以上的插入和缺失突變，其中大多數在短讀長測序數據中不會經常被識別。

Hoischen表示，從長遠來看，我們需要一種真正適用於所有罕見疾病患者的通用基因檢測方法，而長讀長測序技術是目前比較好的一種選擇。

同樣，Carss認為cxSV傾向於出現在基因組中重複且難以按常規順序排列的序列區域。臨床上，如果目的基因位於刪除或重複基因序列附近，那麼精確定位cxSV將尤其重要，因此，長讀長測序技術，如納米孔測序，將成為解決這些問題的最有效方式。在更大的患者隊列中使用長讀長測序技術可以更深入地了解這些變異類型的頻率和分布。但由於納米孔測序的錯誤率相對較高，並且覆蓋率較低，所以還不能被單獨，但這一技術正在迅速改進。

該研究已經證明研究SV否致病的重要性，短讀長和長讀長全基因組測序技術聯合應用可以為解決這一問題提供有效方法，並且證明長讀長測序技術能夠為精確cxSVs的臨床解釋提供強大的技術支持。雖然這一研究領域還沒有達成相關共識，用於確定SV的特徵及其致病性，但這一研究階段的發現比臨床診斷檢測更加重要，並且有助於進行產前診斷，預防出生缺陷。

基因測序技術正在從科學研究向臨床診斷快速轉化，所以在未來的幾年裡，這些測序技術和研究發現很可能會被用於臨床實驗室，為罕見病的診治貢獻一份力量。

參考文獻：

1.Long-Read Sequencing May Help Resolve Complex Structural Variants to Diagnose Rare Diseases

2.Complex Structural Variants Resolved by Short-Read and Long-Read Whole Genome Sequencing in Mendelian Disorders

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