遊離DNA在結直腸癌早期診斷及療效監測中的作用

遊離DNA在結直腸癌早期診斷及

療效監測中的作用

鄭 闊，於冠宇，張 衛

中國實用外科雜誌,2018,38(3):331-333

結直腸癌是消化系統常見惡性腫瘤，發病率和病死率在我國均居惡性腫瘤5位，且近年來顯著上升［1-2］。結直腸癌病人早期癥狀往往不明顯，僅39%的病人診斷時腫瘤仍位於局部，發生遠處轉移的結直腸癌病人5年存活率存活率遠低於局部腫瘤病人［3］。近30年來，隨著內鏡技術在結直腸癌診治中的應用，手術器械的進步［4］，以及放化療技術和靶向治療的發展［5］，我國在結直腸癌發現、診斷、治療等方面均取得了很大的進展［6-7］。但結直腸癌的診治仍面臨著諸多挑戰，大便隱血及腫瘤標記物如癌胚抗原（CEA），對高危人群篩查的敏感性和特異性仍較差［8］。內鏡檢查的人群依從性較低，在我國難以作為普查手段［9］，影像學檢查在評估治療效果和檢測複發轉移方面仍有許多短板。因此，臨床上亟需一種創傷小、敏感度和特異度高且能動態監測的檢查手段，對結直腸癌進行早期診斷、療效評估和預後判斷。近些年研究，血清遊離DNA（cfDNA）能夠在一定程度上反應腫瘤的發生髮展、複發轉移等生物學行為，有望成為新型腫瘤監測靶點［10-13］。本文對cfDNA與結直腸癌的關係進行綜述，以期對結直腸癌進行早期診斷和療效監測。

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cfDNA簡述

cfDNA在正常人體內主要是白細胞和肝臟細胞凋亡釋放入血的DNA片段，在腫瘤病人體內，腫瘤細胞亦可釋放cfDNA入血。cfDNA的生物學指標主要有濃度，完整度和突變基因含量或甲基化水平。其中，cfDNA完整性是指血清遊離DNA長、短片段擴增產物的濃度之比［14］。在結直腸癌病人體內，由於腫瘤組織生長較快，部分結直腸癌細胞缺血壞死，以及巨噬細胞吞噬消化腫瘤細胞，使得大量DNA片段入血，從而血清中cfDNA的濃度發生改變［15-16］。正常凋亡細胞和腫瘤細胞釋放的DNA片段常存在差異，前者DNA片段長度變異性程度小，常＜200 bp，而後者DNA片段長度則變異程度很大，且通常＞200 bp［17］。因此，來源於結直腸癌細胞的DNA片段除改變血清cfDNA濃度外，也改變cfDNA的完整度。此外，部分包含結直腸癌相關的突變基因或是甲基化的片段的DNA片段也能在cfDNA中被檢測。

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cfDNA常用的檢測方法

現階段，國內外開展cfDNA定量測量的方法主要有兩種。第一種是以聚合酶鏈式反應（PCR）技術為基礎的片段擴增法，主要分為實時熒光定量PCR（RT-PCR）和甲基化特異性PCR（MSP）。第二種是信號放大技術檢測法，典型方法為分支DNA檢測（bDNA）。前者具有快捷、靈敏、特異度及敏感度高且操作簡單的特點［18］。

cfDNA完整性檢測的流程包括cfDNA的提取、純化和檢測。其中提取、純化的方法有磁珠吸附法、微柱吸附法、碘化鈉法及酚氯仿法，現在前兩種方法使用較為普遍［19］。cfDNA完整性檢測的主要方法為ALU聚合鏈式反應（ALU-PCR），此外也可通過針對其他人類基因如3-磷酸甘油醛脫氫酶基因（GAPDH）［20］、肥胖基因（Leptin）［21］、β-肌動蛋白（β-actin）［22］分別擴增長、短片段，之後再計算cfDNA的完整性［23］。

對於cfDNA基因突變的檢測方法主要有肽核酸鉗制PCR（PNA-PCR）和傳統巢式PCR。一項研究表明，前者對結直腸癌病人血清cfDNA中kras基因突變的檢出率遠高於後者，並且前者檢出的kras基因狀態是獨立預後因

素［24］。外周血cfDNA甲基化的檢測方法主要為熒光定量PCR［25］。

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cfDNA技術在結直腸癌中的臨床應用

3.1 cfDNA對結直腸癌的早期診斷 在一項前瞻性研究中，通過分支DNA技術（bDNA）對CRC、結直腸息肉和健康人群的血清cfDNA進行檢測，結果顯示CRC病人血清cfDNA濃度明顯高於結直腸息肉和健康人群。並且cfDNA技術對結直腸癌檢測的特異度和敏感度明顯高於血清CEA、CA19-9檢測技術［26］。Umetani等［27］在對CRC病人，壺腹周圍癌（PACs）病人以及健康人群的血清cfDNA濃度和完整性測定中發現，CRC組病人的cfDNA濃度和完整性與健康對照組均有明顯差異，而PACs組只有cfDNA完整性與健康對照組有差異，提示相比於cfDNA濃度，cfDNA完整性檢測對CRC的早期發現更有診斷價值。血清cfDNA濃度和完整性檢測敏感度和特異度均較高，在未來結直腸癌早期診斷中有著廣闊的應用前景。

3.2 cfDNA檢測結直腸癌病人腫瘤負擔 結直腸癌治療前後腫瘤負擔的檢測一直是一個臨床難題。文獻報道，當腫瘤直徑＞7～10 mm或包含1.0×1010個腫瘤細胞時，影像學檢查才有陽性發現［28］。病理活檢難以檢測原發腫瘤周圍的微小病灶和可能存在的遠處微小轉移灶，並且為有創檢查。而cfDNA在檢測結直腸癌治療後腫瘤負擔方面有很大的優勢。一項研究顯示，對來自6例結直腸癌術後複發病人和5例未複發病人的151份血清標本使用微滴數字化PCR技術進行動態監測cfDNA濃度變化，結果顯示，cfDNA血清含量測驗對監測腫瘤負擔有高度敏感性和特異性［11］。該方法相對於影像學檢查還能夠避免因多次放射或造影劑的使用對於病人健康帶來的危害，相比於有創性的病理組織活檢大大降低了檢查風險，因而能夠動態、準確地監測腫瘤負擔。

3.3 cfDNA與結直腸癌的腫瘤異質性 腫瘤細胞異質性在結直腸癌發展過程中廣泛存在，也是結直腸癌產生耐藥性、複發和遠處轉移的重要原因。研究表明，結直腸癌原發灶與轉移灶腫瘤細胞存在明顯的腫瘤異質性，臨床上結直腸癌轉移灶樣本往往難以獲得，僅以原發灶的細胞變異類型指導臨床治療，故具有很大的局限性［29］。而血清cfDNA的檢測，能夠同時對腫瘤病人體內所有的腫瘤細胞亞群進行全局式的檢測，能夠發現結直腸癌細胞不同基因類型，並能對產生耐藥性的腫瘤細胞亞群進行早期發現，從而調整治療手段［30］。

3.4 cfDNA與靶向治療 靶向治療的發展大大改善了結直腸癌病人的存活率，以西妥昔單抗為代表的靶向治療藥物，被預測將會帶來結直腸癌個性化治療的革命性進展。但由於腫瘤細胞異質性的存在，靶向藥物的治療效果仍不盡如人意。cfDNA檢測通過對血清DNA突變片段，DNA甲基化片段以及DNA片段的濃度判斷靶向治療的效果，能夠及時發現耐葯突變，指導病人治療方案的制定和更換［16］。kras基因狀態是西妥昔單抗、帕尼單抗等表皮生長因子受體（EGFR）藥物最重要的療效預測因子［31］。Miranda等［32］的研究表明，結直腸癌轉發灶和肝臟轉移灶之間往往存在著基因突變和表觀遺傳學改變，其中kras基因狀態亦可存在差異。因此，僅僅對結直腸癌原發病灶進行kras基因檢測無法準確地評估抗EGFR藥物的療效［33］，而cfDNA檢測能夠彌補這一缺陷。

3.5 cfDNA與結直腸癌的預後 一系列研究表明，血清cfDNA濃度與結直腸癌病人的預後有關。Bedin等［34］對114例CRC病人，22例結直腸息肉病人和65例健康人群進行血清cfDNA濃度檢測，結果表明，cfDNA含量升高與不良預後顯著相關。張國華等［26］的研究表明，血清cfDNA水平不受年齡、性別、腫瘤部位、TNM分期的影響，提示血清cfDNA濃度升高是結直腸癌不良預後的獨立危險因素，具有更大的應用價值。

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結語

近年來，我國在結直腸癌篩查、診斷、治療等方面已取得了巨大進步，但與西方發達國家仍有一定的差距。如何早期發現結直腸癌，準確評估病人的腫瘤負擔，有效經濟地評估治療方案的效果，是我國現階段結直腸癌相關的臨床難題。近些年發展的循環腫瘤細胞（CTC）檢測技術仍存在以下問題：（1）CTC含量極微，對血液中的CTC的檢測是一個技術難題。（2）腫瘤細胞異質性，使CTC無法反映腫瘤細胞整體的遺傳特點［35］。而cfDNA技術恰好能夠彌補以上方法的不足。通過對血清cfDNA完整性，濃度和基因突變或甲基化的檢測，能夠有效地對結直腸癌危險人群及病人進行全面管理。但許多因素仍影響著cfDNA的檢測結果［36］，例如取樣的部位、手術對於檢測結果的影響，難以建立標準化的檢測結果。此外，cfDNA檢測與影像學檢查、結直腸鏡檢查、血清腫瘤標記物、病理學檢查在臨床上的相互結合還缺少基本共識。因此，cfDNA檢測的臨床上的運用還有很長的路要走。

（參考文獻略）

（2017-12-16收稿 2018-01-10修回）

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