通過血液檢測的多重分析實現可手術癌症的發現與定位

Joshua D. Cohen等在2018年二月的Science發表了一篇文章【Detection and localization of surgically resectable cancers with a multi-analyte blood test】作者通過此文描述了一種通過評估循環蛋白水平和遊離DNA突變水平來發現8種常見癌症的血液檢測方法。作者利用這項名為「Cancer SEEK」的檢測對1005名無遠處轉移，臨床發現患有卵巢、肝臟、胃、胰腺、食管、結直腸、肺或乳腺癌症的患者進行了試驗。這八種類型癌症患者中Cancer SEEK檢測陽性率中位數為70%。該檢測敏感度在對中危風險人群尚無有效篩查手段的5種癌症（卵巢、肝臟、胃、胰腺和食管）中在69%到98%範圍。其特異度＞99%：在812名健康對照人群中有7人發現陽性得分。此外，對於中位83%的患者，Cancer SEEK可以將腫瘤發生的解剖位置範圍縮小。

大部分局灶性癌症可通過手術治癒，而無需全身治療1。然而，一旦出現了遠處轉移，僅憑手術切除是難以治癒癌症的。因此癌症研究的一項主要目標就是在癌症發生遠處轉移前便發現癌變灶。對於許多成年人常見癌症，其從初期成瘤進展為晚期往往需要20到30年的時間2-4。在這漫長的過程中腫瘤細胞似乎僅僅在最後的幾年才會成功種植並形成遠處轉移灶2-5。因此，在腫瘤出現轉移之前留給了作者很長的窗口期來發現癌症。甚至當腫瘤剛剛發生影像學檢查無法發現的轉移時，超過50%的病例仍可以通過全身治療而治癒，如細胞毒藥物和免疫治療6-9。然而，一旦大的轉移性腫瘤形成，現有的治療方式便力不從心了6-9。

目前唯一廣泛應用的癌症早篩血液檢測是基於前列腺特異性抗原（PSA）的評估，而如何恰當使用該檢測始終存在爭議10。已批准的可用於癌症早篩的檢測並不是以血液學檢測為基礎的，其包括結腸鏡檢查、乳腺癌鉬靶和宮頸細胞學檢查。應用於癌症的新型血液學檢測必須具有很高的特異性；否則，將會有過多的健康人群出現假陰性結果，從而導致不必要的隨訪，增加受試人的焦慮。可發現體細胞突變的血液學檢測（「液體活檢」）具有極高的特異性，這是由於其以檢測理論上只存在於異常突變細胞（如癌症）的驅動基因突變為基礎11-18。到目前為止，接受基於突變檢測的液體活檢的癌症患者絕大多數處於病程晚期。此外，尚無研究對健康對照人群進行大規模的上述檢測，而這對於評價檢測特異度又是至關重要的19。檢測敏感度也是液體活檢的一個關鍵點。現有證據表明，早期癌症患者血漿中印記分子含量小於1/ml11,20，對於先前報道的那些同時檢測多種突變的技術來說，檢測如此量的突變往往超出了其能力範圍19,21。液體活檢的另一項關鍵點是鑒定組織來源。同樣的基因突變可誘發多種腫瘤，因此僅憑體液活檢基因組分析仍無法精準定位原發腫瘤的解剖位置。

作者在此描述了一種新型的血液檢測方式，名為CancerSEEK，這項檢測可以兼顧上述液體活檢的關鍵點。該檢測應用了基因變異和蛋白標誌物聯合檢測方法，不僅僅能發現相對早期的癌症，還可以定位癌症的原發部位。

初步研究證實血漿DNA檢測（「液體活檢」）最大靈敏度受局部癌症影響11。進一步研究發現4種蛋白標誌物與1種基因標記聯合檢測（KRAS）可增強胰腺癌早篩靈敏度20。作者試圖以此方式探索出一種通過評估一組在多種實體腫瘤轉移前可以檢測到的蛋白和基因標記水平的篩查方式。作者首先設計了一個PCR為基礎的試驗以同時評估不同類型癌症驅動基因的多個常見突變區域。在設計此試驗的過程中，作者面臨著很多挑戰。首先，這項試驗需要獲取足夠的試驗基礎以適合發現多種癌症的需要。再次，所查詢到的結果必須經過數千次測序以發現罕見突變11,19,21,22。第三，查詢到的結果必須是有限數目的，因為所獲得的越多，出現人造突變的可能就越大，這就會導致信噪比降低。第四，作為一項將來用於癌症篩查的檢測，該檢測必須具有高性價比且經得起高通量考驗，並受到可完成測序數限制。為了克服這些困難，作者開始尋找最小數目的短擴增子以便於作者篩查出納入研究的8種腫瘤各至少一個驅動基因突變。通過分析公開可用的測序數據，作者發現了所需擴增子數目和篩查敏感度的冪率關係，即在60個擴增子時達到穩定（圖1）。一旦達到這種穩定狀態，增加擴增子數目便無法發現更多的腫瘤反而會出現假陰性結果增加的可能性。這種出現效力下降的邊際效益確定了擴增子檢測的最佳數量。

基於這些數據，作者設計了一個61-擴增子板，在16個基因（表1S）中每個基因中每個擴增子平均有33個鹼基對。如圖1所示，該板理論上可篩查出OSMIC資料庫中41%（肝）至95%（胰腺）的癌症23。而實踐當中，該擴增子板表現更佳，其在82%的病例（納入研究的805例癌症患者）中發現了至少1種突變，47%病例中發現了2種突變，8%病例中發現了2種以上突變（圖1，彩色點；圖S1；表S2）。作者採用的PCR為主的測序分析在發現突變方面相比傳統的基因組測序更加敏感，因此作者發現腫瘤的概率大大高於通過COSMIC資料庫預測值。基於這項原發腫瘤DNA分析，作者此項研究ctDNA的預期最高篩查率在肝癌的60%至卵巢癌的100%範圍（圖1）。

利用這小而強的擴增子板，作者探索了兩種途徑來發現血漿中預期的ctDNA罕見突變。首先，作者採用多重PCR的方法使用DNA條碼以直接並獨特地標記每個原始印跡分子。這種設計將大規模平行測序固有誤差降至最低24並能將血漿中稀少的遊離DNA充分利用。此外，作者將血漿中DNA等分為多片段，然後在每個複製子中進行獨立分析。實際上，這樣可以減少每個加樣孔的DNA分子數目；同時也可以增加每個加樣孔出現突變分子的概率，使突變更容易被發現。由於篩查敏感性常常受制於每個複製子突變等位基因的出現概率，這種劃分策略使作者增加了信噪比，同時如果所有血漿DNA可以同時進行評估，作者將能更容易發現罕見突變。

CancerSEEK的第二部分基於蛋白質生物標誌物。以前的研究已經證明，即使使用極其敏感的技術來鑒定，大部分早期腫瘤也不能釋放出可檢測量的ctDNA。許多蛋白質可能用於癌症的早期檢測和診斷已經在文獻中描述。作者搜索了這篇文獻，找到之前已被證明可以檢測出上述8種癌症類型中至少一種的蛋白質，其敏感性> 10％，特異性> 99％。作者鑒定了41種潛在的蛋白質生物標誌物，並對來自正常人和癌症患者的血漿樣品進行了初步研究。作者發現可以通過單一免疫測定平台重複評估這些蛋白質中的39種，然後作者使用該平台測定所有血漿樣品。39種蛋白質中有8種被證明對鑒別癌症患者和健康對照者特別有用。

然後，作者使用CancerSEEK研究了1,005位被診斷患有卵巢癌，肝癌，胃癌，胰腺癌，食管癌，結直腸癌，肺癌或乳腺癌的I至III期癌症的患者。在採集血樣之前，這些患者均未接受新輔助化療，並且在進入研究時沒有明顯的遠處轉移。診斷的中位年齡為64歲（22至93歲）。選擇這8種癌症類型是因為它們在西方人群中很常見，並且因為這些癌症類型尚無廣泛應用於臨床的、基於血樣的早期篩查手段。表S4總結了患者的組織病理學和臨床特徵。介紹中最常見的階段是美國癌症聯合委員會（AJCC）II期，占患者中的49％，其餘患者包括I期（20％）和III期（31％）。表S11總結了8種腫瘤類型每個階段的樣本數量。健康對照隊列由812名中位年齡為55歲（範圍17至88）的個體組成，其沒有已知的癌症病史、高度發育不良、自身免疫性疾病或慢性腎病。

CancerSEEK評估了8種蛋白質的水平和2,001個基因組位置中存在的突變;每個基因組位置可以以幾種方式突變（單個鹼基取代、插入或缺失）。檢測基因中突變的存在或任何蛋白質水平的升高都將會將患者歸類為陽性。因此，必須採用嚴格的統計方法來確保測試的準確性。作者使用對數比來評估突變，並將它們納入邏輯回歸演算法，該演算法考慮到突變數據和蛋白質生物標誌物水平以對CancerSEEK測試結果（補充材料）進行評分。平均敏感性和特異性由10次交叉驗證的10次迭代確定。在一個代表性迭代中，整個癌症患者和對照組隊列的受試者工作特徵（ROC）曲線顯示在圖2A中。

在所評估的8種癌症類型中，CancerSEEK的中位敏感性為70％（P 99％;即沒有已知癌症的812名健康個體中只有7個得分為陽性。作者不能確定在健康隊列中發現的少數「假陽性」個體確實未罹患癌症，但將它們歸類為假陽性提供了對數據進行分類和解釋的最保守的方法。

該演算法最重要的測試特徵是存在ctDNA突變，其次是CA-125，CEA，CA19-9，PRL，HGF（肝細胞生長因子），OPN（骨橋蛋白），MPO（髓過氧化物酶）和TIMP-1（金屬蛋白酶1）蛋白水平的組織抑製劑（表S9）。CancerSEEK中使用的每種ctDNA和蛋白質特徵的瀑布圖顯示了它們在患有和不患有癌症的個體中的分布（圖S2）。表S9顯示了CancerSEEK中所使用的ctDNA和蛋白質特徵的重要性等級排列，而圖S3所示的主成分分析則顯示了有無癌症的個體的聚類。表S5和S6中提供了完整的數據集，包括研究的血漿樣品中所有蛋白質水平和所鑒別的DNA突變。從圖S4可以看出，這裡用來稱取樣本正數的方法的概率性而不是確定性性質;各圖代表了當一個特定要素從分析中排除時CancerSEEK的靈敏度表現。

篩查試驗最重要的特徵之一是能夠在早期發現癌症。CancerSEEK在最常見腫瘤分期（II期）的中位敏感性為73％，III期癌症相似（78％），而I期癌症的敏感性下降（43％）（圖2B）。在對於早期癌症（I期）的敏感性中，肝癌（100％）是最高的，食管癌（20％）是最低的。

液體活檢的原理是血漿中的突變DNA模板來源於死亡的癌細胞，因此可用作腫瘤形成的精確特異性標記。為了調查CancerSEEK是否符合這一預期，作者評估了153位患者的腫瘤組織，這些患者ctDNA可以在有統計學意義水平（補充材料）中檢測並且可以獲得原發性腫瘤。作者發現在這153例患者中有138例（90％）血漿中DNA突變與其原發腫瘤中發現的突變相同（表S7）。在所有8種癌症類型中，血漿和原發腫瘤的DNA突變都具有明確的一致性，在卵巢癌和胰腺癌中為100％，在胃癌中為82％。

液體活檢的局限性之一在於它們無法確定檢測陽性的患者的癌症類型，這給臨床隨訪帶來了挑戰。為了檢查CancerSEEK測試是否可以幫助識別癌症組織的來源，作者使用有監督的機器學習來預測CancerSEEK陽性患者的潛在癌症類型。輸入演算法考慮了ctDNA和蛋白質生物標誌物水平以及患者的性別（補充材料）。預測的主要目的之一是確定在癌症診斷或癌症監測後最恰當的後續檢測手段。因此，作者將食管癌和胃癌患者作為一組，因為內窺鏡檢查是這兩種情況下的最佳後續檢查。然後作者使用這個演算法（補充材料）來研究在CancerSEEK測試中得分為陽性的626個癌症患者。在沒有任何有關患者的臨床信息的情況下，作者能夠在中位數值為83％患者中將癌症的來源定位於兩個解剖部位（圖3，表S8; P

總之，作者設計了一種可以檢測八種常見實體瘤類型的多分析物血液檢測方法。將完全不同的介質與不同的作用機制相結合的優勢在治療學方面已經得到了廣泛認可（28-30），但尚未常規應用於臨床診斷。作者將蛋白質生物標誌物與遺傳學生物標誌物結合起來，在提高靈敏度的同時，保證了特異性不會出現顯著下降。其他癌症生物標誌物，如代謝產物，mRNA轉錄物，miRNA或甲基化DNA序列可以類似地組合以提高癌症位點定位的敏感性。這種多分析物測試並不著取代其他非血液類的篩查測試，如乳腺癌或結腸直腸癌的篩查測試，而是從另一角度幫助識別最可能患有惡性腫瘤的患者。

作者的研究存在如下的局限性。第一，作者研究中的患者隊列由患有已知癌症的個體組成，大多數是基於疾病癥狀診斷的。這些患者在研究入組時沒有臨床上明顯的腫瘤轉移，但真正篩查環境中的大多數患者的疾病進展較晚，且檢測的敏感性可能低於此處報道的敏感性。第二，作者的對照僅限於健康個體，而在真正的癌症篩查環境中，一些個體可能患有炎性疾病或其他疾病，可能導致假陽性結果的比例高於作者的研究中觀察到的結果。第三，儘管多重交叉驗證是一項有效的且廣泛使用的技術，可以用於證明本研究規模隊列的敏感性和特異性，但作者無法使用完全獨立的一組案例進行測試，。第四，作者的隊列中每種類型的癌症的比例都是有目的的，並不代表美國整體人群的癌症比例，因為作者想要利用現有資源評估每種癌症類型至少50例。當對美國的實際發病率加權時，作者估計CancerSEEK在所有八種癌症類型中的敏感性為55％。重要的是，這種加權不會影響CancerSEEK對5種癌症類型(卵巢、肝臟、胃、胰腺和食道)的高敏感性(69%到98%)，因為這些癌症沒有針對平均風險個體的篩查測試。

作者的研究為許多類型的癌症的多分析物血液檢測奠定了概念和實踐基礎。作者估計這項測試的費用將少於500美元，這比某些僅針對單一類型的癌症的篩查測試(比如結腸鏡檢查)費用要低得多。本文研究的8種癌症類型在2017年美國估計的癌症死亡人數中佔36萬(60%)，這些癌症的早期發現可以有效地減少患者的死亡。為了真正保證CancerSEEK的臨床實用性並證明其可以拯救生命，作者還需要對大量人群進行所有癌症類型的前瞻性研究。

圖1.基於PCR測定血漿樣品中腫瘤特異性突變的研究。彩色曲線表明在本研究中評估的八種類型的癌症的比例可以用數量增多的短（

圖2. CancerSEEK的性能。（A）CancerSEEK的受試者工作特徵（ROC）曲線。曲線上的紅點表示測試的特異性> 99％時的平均表現（62％）。誤差線表示敏感性和特異性在這個特定點的95％置信區間。如正文中所述，評估的8種癌症類型中位數表現為70％。（B）CancerSEEK對不同腫瘤分期的敏感性。柱形圖代表八種癌症類型的中位敏感度，誤差線代表中位數的標準誤差。（C）CancerSEEK對不同腫瘤類型的敏感性。誤差線代表95％的置信區間。

圖3.通過監督學習識別CancerSEEK分類為陽性的患者的癌症類型。百分比對應於兩種最可能類型之一（淺和深藍條之和）或最可能類型（淺藍條）分類正確的患者比例。表S8中提供了所有癌症類型的所有患者的預測。誤差線代表95％的置信區間。

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