核糖體蛋白L41對人視網膜母細胞瘤Y79細胞增殖和凋亡的影響及其機制

本文作者：耿雯，秦豐，任佳緒，徐曉鶴，王愛媛

作者單位：110004　遼寧省瀋陽市，中國醫科大學附屬盛京醫院眼科

摘要目的　研究核糖體蛋白L41（ribosomal protein L41，RPL41）對人視網膜母細胞瘤Y79細胞增殖和凋亡的影響及其機制。方法　將人視網膜母細胞瘤Y79細胞接種於含體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640培養液中傳代培養。根據藥物處理濃度分為對照組（RPL41濃度為0 μmol·L-1）、40 μmol·L-1RPL41處理組、80 μmol·L-1RPL41處理組、120 μmol·L-1RPL41處理組。CellTiter-Glo熒光細胞活性檢測系統檢測各組細胞活性；流式細胞儀檢測100 μmol·L-1RPL41處理後細胞凋亡率，Hoechst染色觀察細胞凋亡形態；Western blot檢測各組細胞中活化轉錄因子4（activating transcription factor 4，ATF4）的含量。結果　與對照組相比，40 μmol·L-1RPL41處理組細胞活性為（97.9±1.5）%，無明顯變化，差異無統計學意義（P=0.055）；80 μmol·L-1RPL41處理組細胞活性為（87.6±1.8）%，120 μmol·L-1RPL41處理組為（63.9±2.0）%，與對照組相比差異均有統計學意義（均為P-1RPL41能夠促進Y79細胞凋亡，凋亡率為（17.33±2.47）% 。100 μmol·L-1RPL41處理組凋亡細胞與正常細胞相比，細胞顏色較亮，細胞體積較小。40 μmol·L-1RPL41處理組ATF4蛋白含量為0.76±0.04，80 μmol·L-1RPL41處理組為0.29±0.04，120 μmol·L-1RPL41處理組為0.29±0.05，與對照組相比，差異均有統計學意義（均為P

視網膜母細胞瘤（retinoblastoma，RB）是小兒最常見的原發性眼內腫瘤，嚴重危害患兒的視力和生命健康。目前臨床對小兒RB常規的治療方法包括眼球摘除、冷凍療法、激光光凝、全身或局部化學治療、放射治療等，化學治療聯合局部治療是現階段國際上的首選療法［1-2］。核糖體蛋白L41（ribosomal protein L41，RPL41）是新近發現的一個抑癌基因，在多種腫瘤細胞中低表達［3］。合成的小分子多肽RPL41能夠特異性降解腫瘤細胞內質網應激關鍵因子——活化轉錄因子4（activating transcription factor 4，ATF4），破壞腫瘤細胞自身的保護應答機制，導致細胞死亡［4］。本實驗旨在研究RPL41對人RBY79細胞增殖和凋亡的影響，探討其作用機制，為RB的治療提供新的思路和理論依據。

1

材料與方法

1.1　材料和試劑人RB Y79細胞株（美國模式培養物集存庫）；RPL41（規格：100 mg，純度≥95%）由南京Genscript公司合成；RPMI 1640培養基、胎牛血清（以色列Biological Industries公司）；CellTiter-Glo熒光細胞檢測試劑盒（美國Promega公司）；Annexin V-FITC凋亡試劑盒（美國Ebioscience公司）；Hoechst3334染色試劑盒、山羊抗兔二抗（美國Thermo Fisher Scientific公司）；兔抗鼠抗體ATF4（美國Proteintech公司）；內參β-actin（美國Santa Cruz公司）。

1.2　方法

1.2.1　細胞培養及藥物處理　將Y79細胞接種於含體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640培養液中，置於37 ℃、體積分數5%CO2培養箱中傳代培養，取對數生長期細胞用於實驗。為最大限度保持多肽的活性，用雙蒸水溶解RPL41速凍乾粉至終濃度10 mmol·L-1，分裝於-80 ℃冰箱保存。細胞加藥前，取分裝的RPL41，加入雙蒸水稀釋為2 mmol·L-1溶液。根據藥物處理濃度分為對照組（RPL41濃度為0 μmol·L-1）、40 μmol·L-1RPL41處理組、80 μmol·L-1RPL41處理組、120 μmol·L-1RPL41處理組。

1.2.2　細胞活性檢測　取指數生長期的人RB Y79細胞，1000 r·min-1離心5 min。棄上清後，用無血清1640培養基將細胞懸起，根據實驗需求調整細胞數每孔為50×103個至96孔板中，輕輕混勻。加入不同體積的RPL41，使RPL41最終濃度分別為40 μmol·L-1、80 μmol·L-1、120 μmol·L-1。20 min後每孔各加入10 μL純血清，繼續培養24 h。檢測細胞活性時，用8道排槍加入100 μL CellTiter-Glo熒光細胞檢測試劑，振蕩2 min，室溫靜置10 min。酶標儀讀取熒光值。細胞活性=（給葯組熒光值-背景熒光值）/（對照組熒光值-背景熒光值）。

1.2.3　細胞凋亡情況檢測　取指數生長期的人RB Y79細胞，離心棄上清，用無血清培養基懸起，調整細胞數每孔為100×103個至6孔板中。加入相應體積RPL41使其終濃度為100 μmol·L-1，20 min後每孔各加入200 μL純血清，繼續培養24 h，將細胞懸液離心（1000 r·min-1離心5 min）。棄上清液，加 1 mL PBS清洗一次。用200 μL Binding buffer製備單細胞懸液，每管加入5 μL Annexin V-FITC混勻後，再加入10 μL PI混勻，避光，室溫下反應15 min，1 h內流式細胞儀檢測。設置空細胞對照，並按要求設置重複。

1.2.4　Hoechst染色　Hoechst是一種能穿透細胞膜的DNA熒光染料，能將正常細胞染成淡藍色。當細胞發生凋亡時，細胞呈現染色質濃縮，邊緣化，核膜裂解，染色質被分割成塊狀，出現凋亡小體等典型的凋亡形態［5］。人RB Y79細胞經100 μmol·L-1RPL41處理，繼續培養24 h。40 g·L-1多聚甲醛固定10 min後，加Hoechst33342染色，Hoechst33342終濃度為1 mg·L-1，室溫避光孵育10 min，在倒置熒光顯微鏡下觀察，拍照。

1.2.5　Western blot檢測ATF4含量　人RB Y79細胞經40 μmol·L-1、80 μmol·L-1、120 μmol·L-1RPL41處理，繼續培養24 h。收集細胞，冰上裂解細胞，BCA法進行蛋白定量。上樣量20 μg蛋白，聚丙烯醯胺凝膠電泳，電轉移至PVDF 膜，50 g·L-1脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入一抗4 ℃孵育過夜，抗體稀釋濃度為1∶500。TBST洗3遍，加入二抗，室溫孵育1 h。ECL化學發光。用凝膠圖像處理系統Image J分析目標條帶的相對分子質量和光密度值。

1.3　統計學方法採用GraphPad Prism 7.0統計軟體進行統計分析，數據採用x?±s表示。兩組比較採用t檢驗，P

2

結果

2.1　RPL41對人RB Y79細胞增殖的影響不同濃度的RPL41處理人RB Y79細胞後，用CellTiter-Glo熒光細胞檢測系統檢測細胞活性。與對照組相比，40 μmol·L-1RPL41處理組細胞活性為（97.9±1.5）%，無明顯變化，差異無統計學意義（P=0.055）；80 μmol·L-1RPL41處理組細胞活性為（87.6±1.8）%，120 μmol·L-1RPL41處理組為（63.9±2.0）%，與對照組相比差異均有統計學意義（均為P

2.2　RPL41對人RB Y79細胞凋亡的影響100 μmol·L-1RPL41處理人RB Y79細胞24 h後，使用Annexin V/PI流式細胞儀對細胞凋亡情況進行檢測，結果表明與對照組相比，100 μmol·L-1RPL41能夠促進人RB Y79細胞凋亡，凋亡率為（17.33±2.47）%，差異有統計學意義（P

2.3　Hoechst染色觀察細胞凋亡形態Hoechst染料與DNA的A-T鹼基區結合，紫外光激發時發出明亮的藍紫色光。對照組正常的人RB Y79細胞為淡藍色圓形顆粒，細胞形態大而規則；100 μmol·L-1RPL41處理組凋亡細胞與正常細胞相比，細胞顏色較亮，細胞體積較小(圖2)。

2.4　Western blot檢測人RB Y79細胞中ATF4蛋白的含量分別用不同濃度的RPL41處理人RB Y79細胞，24 h後檢測各組細胞中ATF4蛋白含量。40 μmol·L-1RPL41處理組ATF4蛋白含量為0.76±0.04，80 μmol·L-1RPL41處理組為0.29±0.04，120 μmol·L-1RPL41處理組為0.29±0.05，與對照組相比，差異均有統計學意義（均為P

3

討論

目前治療RB的藥物均有很強毒性，尤其有耳毒性、腎毒性，並可繼發白血病等，對兒童有很大的危害，有些可能誘發機體耐葯，對中晚期RB的療效不佳［6］。因此，如何提高藥物療效，減少細胞耐藥性和機體不良反應，成為RB治療的研究熱點。

ATF4是調節腫瘤細胞在應激環境下生存的一個重要應激反應基因，其參與的PERK/eIF2α/ATF4/CHOP通路是內質網應激的重要通路之一［7］。腫瘤細胞在各種應激信號作用下，通過PERK信號轉導通路誘導真核轉錄起始因子2α磷酸化，特異性增加ATF4 mRNA的翻譯，以促進腫瘤細胞在應激環境中的自適應性保護反應。目前發現ATF4主要經由以下三個方面對腫瘤細胞進行調控：（1）通過調節與線粒體功能、氨基酸代謝和轉運以及氧化還原反應相關的一些基因來保證蛋白生物合成所需要的氨基酸，以合成應激條件下維持細胞生存最低限度的必需蛋白，在調節細胞損傷修復和凋亡過程中發揮重要作用［8］；（2）與惡性腫瘤的浸潤和轉移密切相關，ATF4能夠通過調節VEGF-A、內皮細胞選擇素、尿激酶型纖溶酶原激活劑促進腫瘤細胞轉移［9-11］，上述因子都是腫瘤治療的潛在靶點；（3）與細胞的耐藥性也密切相關［12］，其機制尚不清楚，目前認為可能與ATF4誘導細胞自噬，促進DNA損傷修復，以及上調細胞內谷胱甘肽等有關。綜上所述，ATF4是腫瘤細胞在多種細胞應激信號下被激活的一個重要轉錄因子，抗ATF4已成為腫瘤治療的一個新靶點。

RPL41是我們前期發現的一個新的腫瘤抑制基因，合成的RPL41蛋白多肽是一種富含精氨酸和賴氨酸的小分子多肽，相對分子質量非常小，滲透性強，能夠自行穿越細胞膜，易被腫瘤組織攝取［13］，具有研發抗腫瘤藥物的重要優點。RPL41能夠誘導ATF4蛋白磷酸化，使其從細胞核移位至細胞漿蛋白酶體中迅速降解，是目前唯一一種抗ATF4的藥物。而RPL41本身與細胞有絲分裂密切相關，敲除RPL41基因後，細胞有絲分裂出現異常，導致細胞惡性轉化［3］。本實驗證實了經RPL41處理的人RB Y79細胞，細胞活性明顯降低，凋亡率上升，機制可能與其特異性降解細胞中ATF4含量有關。此外，本課題組研究發現，RPL41可以和其他抗腫瘤藥物聯合發揮抗腫瘤作用。在低劑量使用時，RPL41能夠增加腫瘤細胞A549對DNA損傷化學治療藥物順鉑的敏感性［4］，說明在達到對腫瘤疾病同等治療效果時，RPL41會減少化學治療藥物的用量，從而減輕化學治療藥物的毒副作用。

參考文獻略

喜歡這篇文章嗎？立刻分享出去讓更多人知道吧！