食源性雌二醇殘留檢測技術研究進展

白宇1，胡景炎1，張井2*

1(溫州科技職業學院 動物科學學院，浙江 溫州，325006) 2(溫州市農業科學研究院，農業部農產品質量安全風險評估實驗站，浙江 溫州，325006)

摘 要具有促生長、催情作用的雌二醇在畜牧業生產中已發揮重要作用，然而廣泛的不當應用常導致食源性雌二醇殘留的嚴重後果。當前，雌二醇殘留導致的生物雌激素樣作用、弱致癌性已引起全世界的廣泛關注，加強食源性雌二醇殘留的監測與管控，加強對雌二醇殘留檢測技術的研究與應用，對於保障食品安全與人類生理健康等具有十分重要的現實意義。該文概述了食源性雌二醇的主要來源、殘留危害分析和主要檢測分析技術。

關鍵詞雌二醇；殘留風險；潛在致癌性；檢測技術

雌二醇(estradiol，E2)作為最具活性的天然性激素之一，在生物機體內含量最多，活性最強，主要由機體內卵泡顆粒細胞合成和分泌，是雌激素中一類含18個碳原子的類固醇激素，能促進動物性器官、第二性徵及乳腺的維持和發育，增強妊娠晚期子宮的自發收縮活動以及增強子宮對催產素的反應，維持鈣平衡以致影響骨生長，改變脂肪代謝等功能，與動物以及人類的生長繁殖息息相關[1]。但是E2也直接或間接地干擾正常內分泌物質的合成、釋放和代謝等過程，導致一系列的神經系統異常、生殖功能異常和免疫功能異常。

E2這類具有性激素樣活性的化合物，於50年前便已作為同化劑在畜牧業生產中應用，用以促進生長和提高飼料轉化率。然而，由於雌激素類添加劑在動物體內的不完全代謝，主要的殘留代謝產物仍具有生物活性，最終通過食物鏈作用富集在生物機體的脂肪組織，不僅對動物健康形成危害，而且對人類也會形成長期毒害作用，甚至對生態環境造成直接或間接危害。20世紀80年代開始，許多國家和組織就已經通過立法來限制或禁止在食品動物中使用甾類同化激素[2]。歐盟自1988年禁止所有甾類同化激素用於促生長目的，制定了針對歐盟國家內部流通及外部輸入的動物源性食品的一整套嚴格的監管措施[3]。現今，美國、歐盟、日本等發達國家和地區已形成完善的檢測體系，而我國也在本世紀初開始建立國家獸葯殘留監控體系和獸葯安全評價系統，但迄今為止雌激素類藥物殘留的檢測和評價體系還不是十分完善。

隨著人們對動物源性激素類藥物殘留危害性認知的逐漸增強，E2所誘發的食品安全問題也越發凸顯。應用可靠的檢測分析方法檢測可食性畜產品中的E2濃度是確保食品安全的重要措施。目前，常用的理化儀器檢測方法有高效液相色譜法和氣相色譜-質譜聯用法等；免疫學分析法有放射性免疫分析法、酶聯免疫吸附法以及熒光免疫分析法等。

1 動物性食品中E2的主要來源

1.1 肉類生產

動物性食品中雌激素來源比較廣泛，部分來源於飼料中E2的非法添加，正常情況下每公斤飼料只需加入20～70 mg的E2，就能達到促進動物體內鈣、氮、磷等元素吸收的功效；當E2達到0.3 nmol/L的生理濃度，就可以刺激細胞迅速生長[2-3]。因此，一些養殖戶為了追求快速促進動物生長發育的功效，違規在飼料中添加雌激素及其衍生類物質等違禁藥物。E2對於機體蛋白的合成有促進作用，在氮的代謝中發揮著重要作用，能提高機體對氨基酸的利用率。肉牛若以E2作為增重劑，促進蛋白質合成的同時，可以減少氨的排泄量，其日增重和飼料報酬能得到顯著提高，而且對飼料消化率無明顯影響，此類天然激素作為增重劑在一些國家仍在使用。20世紀60～70年代的美國約80%以上肥育牛生產過程中用到雌激素，最初用於牛皮下埋植劑或注射，幼畜斷奶後埋植於耳後皮下，育肥階段改為飼料添加劑方式投藥。

為保證動物性食品衛生安全，我國農業部公告第176號文件明確規定在飼料及動物飲用水中嚴禁加入雌二醇、己烯雌酚、苯甲酸雌二醇等激素類藥物[4]，農業部235號公告也表明在所有可食性動物組織中不得檢出雌二醇[5]。然而我國畜牧業總量大，大型集約化、中小規模以及散戶等各種養殖模式並存，濫用雌激素的現象仍然普遍存在，監管困難。大部分的濫用現象歸結於一種無意識，對於所做之事的不計後果，一方面是由於對後果的「不可知」，另一方面是對後果的「不感知」。「不可知」是由於農戶對專業知識的缺乏，意識不到E2對於人體以及環境的危害；而「不感知」是由於生產者為追求經濟效益最大化而產生的一種群體潛意識，沉默的大多數抱著僥倖心理，即使明明知曉E2殘留會帶來一些危害，仍然潛意識中不去深入思考造成相關的危害。這就要求政府充分發揮市場調控的職能，對市場具有監控作用的政府職能部門不僅要做好監控管理工作，更需要加強對養殖農戶相關專業知識的宣傳普及工作。

1.2 乳製品

有報道稱西方飲食中食源性雌激素有60%～70%來源於牛奶和乳製品，而牛奶中75%都是來自於妊娠奶牛。現代奶牛生產中多是用的改良奶牛，改良奶牛在分娩3個月後就可以利用人工授精來替代漫長的自然交配過程，整個懷孕期間會持續泌乳，妊娠中後期雌激素含量比平常血清中的含量更高，血液循環中E2通過血-乳屏障進入乳腺，使得E2在乳腺中的濃度遠遠高於外周循環系統中的濃度，進而造成牛奶中E2含量相應升高[6]。因此市售牛奶相比於傳統牛奶相應雌二醇的含量勢必會發生改變。儘管商業化牛奶在銷售前都會經過均一化作用和巴氏滅菌法處理，但這樣的處理方式不能徹底滅活E2這類激素[7]。周虹等對現代改良奶牛與傳統蒙古黃牛的牛奶研究對比中發現[8]，儘管市售牛奶中E2含量是傳統黃牛奶中E2含量的1.5倍，雌酮含量是傳統黃牛奶的80倍，但由於奶牛在品種、飼養方式和受孕方式及產奶量的差異，牛奶中含有一定量的雌激素具有一定合理性，不能就此否定牛奶的營養價值。

另外在奶牛生產中，經常使用苯甲酸雌二醇(代謝標誌物為E2)與孕激素誘導奶牛發情，而且能誘導泌乳，E2主要用作催情劑而非「催奶素」，同樣會導致E2這類激素殘留。有時為了增加牛奶產量，通常使用含動物蛋白的高蛋白飼料飼餵，這樣進一步導致牛奶中的雌激素殘留量增加。

目前我國奶牛生產業中小規模和散養戶仍然佔有相當大的比重，奶源品質控制難度較大，規範化使用獸葯，且按照規定嚴格遵守休葯期都較為困難。並且我國對於激素類藥物殘留一直未納入乳品的日常檢測，因此急需加強該類藥物殘留的監控與管控，並在食品安全風險監測項目中納入相應的監測內容。

1.3 保健類藥物

根據倪繼紅等對人蔘蜂皇漿影響兒童生長發育的臨床與實驗研究[9]，發現臨床16例服藥兒童因服用蜂乳、花粉、人蔘、蜂皇漿等引起性早熟，同時，性激素分泌也受到一定影響，動物實驗結果也證實喂葯幼鼠體重、卵巢和子宮重量顯著增加，卵泡的成熟和排卵、睾丸的生精功能明顯提高。採用放射免疫分析法(radioimmunoassay,RIA)測定人蔘蜂皇漿中E2和睾酮含量，顯示E2含量為73～134 pg/mL，睾酮含量為45～71 ng/mL。蜂皇漿和人蔘都能興奮垂體分泌促性腺激素，某些補品中含有的蜂乳、花粉、人蔘等成分，如人蔘含有增強RNA聚合酶I和II活性的成分，刺激肝、腎、睾丸等許多器官組織核酸及蛋白質的合成，從而影響生長發育。

1.4 水產品

雌激素類藥物還具有縮短生長周期和影響動物性別分化的效應，大多被不法水產養殖戶添加在飼料中用以提高水產品的產量。此外，水環境作為環境雌激素最大的存儲庫，隨著水體污染的日益嚴重，水產品的質量和安全正在受到環境雌激素的污染。據JURGENS等[10]報道表明，在英國多地的河流、湖泊、污水處理口等均有雌激素的富集。而我國的多個水域，包括長江和嘉陵江流域及其水產品中也均發現雌激素[11]。20世紀90年代，美國的五大湖區域也出現了魚類雌性化、生殖發育異常等現象，而排入水中的天然或人工合成的環境雌激素是導致這一後果的主要原因[12]。此外，當水產養殖水體受到畜牧業養殖污染，如含有雌激素的畜禽排泄物未經法定處理程序排放，造成水產動物生長過程體內E2一定的蓄積，通過食物鏈進入人體後，仍具有較強的生物活性。

2 E2殘留的危害

2.1 E2殘留的雌激素樣作用

食源性E2模擬或拮抗正常的內源性激素，與體內正常的雌激素髮生協同反應，促使機體雌激素活性增強，主要表現為雌激素樣作用。青春期前兒童血清中E2濃度(酶免疫法)很少超過2 ng/L，這階段兒童對於外源性激素的敏感性高，微量的E2即可影響兒童的成長發育，外環境中稍有過量的E2殘留污染就會使兒童暴露在危險當中。

經過基因改良的奶牛幾乎在整個懷孕期都在泌乳，因此現代的商業牛奶中含有大量的雌激素。硫酸雌酮作為牛奶中的主要雌激素，具有較高的生物活性，攝入人體後迅速轉換為雌酮(E1)和E2，兒童和青少年作為奶及乳製品的主要的消費人群，其中的E2殘留將會對該類人群的生長發育產生負面影響[6]。MARUYAMA等[13]通過研究攝入商品化牛奶人群的尿液提取雌激素，發現E2的含量均有所升高，2 h內其濃度幾乎不改變，其代謝過程變得非常緩慢。進一步研究顯示原因就在於促性腺激素分泌被抑制，其次是睾酮的分泌減少，這便會對男性的生殖健康產生影響，還會引起女性的亞臨床性腺機能減退。因此認為商品化牛奶的攝入是影響兒童性早熟以及男孩女性化的主要原因之一[6,11]。

MATAGNE等[14]研究E2對幼年雌鼠下丘腦促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone,GnRH)脈衝式分泌的影響時，發現小鼠注射E2後，出現GnRH脈衝間隙減少，陰道開口時間提前，首次發情時間提前等現象。由此認為E2影響新生雌鼠大腦中與性激素分泌有關細胞的分化，從而導致性早熟。侯麗艷等[15]發現雌激素主要是通過干擾下丘腦-垂體-睾丸軸，抑制垂體促性腺激素分泌而降低循環系統中睾丸睾酮濃度，進而破壞生殖系統生長發育。

2.2 E2殘留的免疫毒性

內分泌激素不僅能影響生長、發育和生殖，也能影響免疫系統，如性激素影響免疫應答。內分泌系統與免疫系統之間能夠相互誘導和相互作用，2個系統之間擁有一套共同的作為信息傳遞者的激素淋巴因子等信息分子，並且與相同結構的受體結合，已證明免疫系統中具有環境內分泌干擾物的作用位點[16]。尹大強等[17]報道幾種激素對鯽魚淋巴細胞增殖的影響，其中E2(0.002～20 ng/mL)對鯽魚淋巴細胞增殖有明顯的誘導作用，判定E2、睾酮和雙酚A等環境內分泌干擾物具有潛在的免疫毒性。

2.3 E2殘留的致癌風險

毒理學和流行病學研究表明，人體內E2的含量與乳腺癌、卵巢癌和子宮內膜肌瘤等疾病有很大相關性，部分學者將E2歸類為一種致癌物質。然而E2的潛在致癌性向來都是有爭議的，早期在Ames試驗(細菌回復突變試驗)和一些其他細胞試驗中都否定了雌激素包括E2的致突變活性，一度將其歸類為非誘變性和非遺傳毒性[18]。然而，這些早期的試驗結果與近年已確定的具有潛在致突變性的各種類型的基因損傷並不一致。

QIN等[19]統計西方國家的牛奶消費與雌激素循環水平數據顯示，西方男性罹患前列腺癌的患病率比亞洲男性更高，揭示牛奶中的雌激素是導致前列腺癌的重要因素之一。因此腫瘤的發生可能與組織或細胞中的E2或E2代謝物相關聯[20]。通過TRIPATHI等[21]以生物素標記E2的研究表明，E2及其代謝物導致染色體或基因異常的機理可歸納為以下幾點：(1)基因序列的鹼基替換、刪除與插入；(2)染色體數的擴增及丟失；(3)染色體易位；(4)基因擴增。

2.3.1 E2代謝物作用

E2代謝物——2-羥雌二醇、4-羥雌二醇，以及相應的醌可以遊離自由基為媒介造成直接或間接的DNA損傷[22]。肝臟中的細胞色素P450促使E2代謝主要轉化成2-羥基雌二醇，只有15%～20%是4-羥基雌二醇，而在子宮、乳腺、卵巢中的P450使E2主要轉化為4-羥基雌二醇，並且由鄰苯二酚-O-甲基轉移酶將其甲基化。兒茶酚雌能以半醌自由基的中間形式，通過在醌與氫醌(兒茶酚)之間的氧化還原循環，代謝生成自由基，繞過半醌這個中間代謝物則少了自由基的產生。而羥自由基與DNA共價結合形成DNA加合物，又可共價修飾嘌呤或嘧啶，從而導致基因組不穩定，突變形成原癌基因(c-myc)，而c-myc擴增並發染色體畸變，這是致癌進程中重要的一個要素[20]。

HUSEBY[23]等建立的小鼠動物模型揭示E2的直接致癌作用。在倉鼠腎腫瘤模型中發現，E2通過特殊的4-羥基酶催化轉化為4-羥基雌二醇造成DNA損傷，而且代謝產物4-羥雌二醇通過激活兒茶酚的活性半醌啟動誘導腫瘤的形成。

2.3.2 E2的直接作用

E2可直接破壞瓦解細胞中的微管結構，抑制染色體的有絲分裂，進而導致異倍體的產生[24]。染色體的異倍體性又誘導細胞轉化，從而使細胞獲得致腫瘤性。E2還可介導細胞中某些癌基因的表達，如E2能刺激乳腺癌相關肽基因(pS2)的表達，誘導靶器官形成腫瘤[25]。

KONG等[26]報道不同濃度E2影響中國倉鼠肺成纖維細胞(V79) 試驗，發現10-10mol/L的E2具有轉移酶基因(hprt)編碼序列的致突變效應，濃度升高反而觀測不到這種作用。E2能提高hprt在V79細胞中的突變頻率，又能誘導hprt分子性質的改變，包括外顯子的缺失，鹼基轉移和插入，嘧啶與嘌呤的顛換等變化。

通過TAKASHI等[19]對牛奶中的雌激素與前列腺癌的相關性研究顯示，E2對與生殖相關的類固醇的合成過程中的酶起到抑制作用，使其合成受阻，影響干擾機體內分泌生殖系統的正常運作，在前列腺癌形成過程中起誘發機制，引起前列腺的DNA損傷。

2.3.3 雌激素結合受體作用

JENSEN等[27]通過對雌激素的深入研究發現雌激素受體作用機制：當E2穿過細胞膜進入細胞內，在細胞質中與一次性蛋白受體相結合，這種結合可將受體活化，形成典型的配體激素受體複合物，並遷移到細胞核，通過和特定DNA序列(如PS2基因)結合而啟動靶基因表達，引起細胞的變化從而發揮生物學效應。

雌激素受體作為雌激素促生長效應之必要中介，其在乳腺癌細胞的生長過程中也發揮了關鍵性作用，因此雌激素受體對於乳腺癌的早期篩查以及治療效果評測也發揮著重要的作用[28]。

通過對E2的危險性分析發現，E2能發揮基因毒性是通過以醌介導反應的兒茶酚雌的代謝活化，以及後續的代謝物氧化還原循環。經過實驗動物以及細胞水平試驗驗證E2的殘留存在如下風險：(1)誘導染色體結構畸變；(2)產生異倍染色體；(3)c-myc基因擴增。或許，單一風險不足以引髮乳腺癌等相關疾病，但是一系列細胞和基因分子水平的改變，便能夠誘發腫瘤的形成，如激素依賴性器官腫瘤；基因突變引發腫瘤；破壞體內遺傳物質，使染色體結構或數目發生變化。

3 E2殘留檢測分析技術

3.1 儀器分析法

儀器分析法主要為色譜法，包括高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)、液相色譜-質譜聯用法(liquid chromatograph-mass spectrometer,LC-MS)，以及氣相色譜-質譜聯用法(gas chromatograph-mass spectrometer,GC-MS)。GC-MS因其將色譜的高效分離能力和質譜強大的定性能力相結合，成為目前獸葯殘留分析領域中最強大、最有力的定性定量工具。然而，儀器分析方法又存在需要精密昂貴的儀器，樣品預處理複雜耗時，衍生化會造成目標類固醇的損失或降解等弊端，因此在實踐中難以做到快速檢測大量樣品，不能滿足現場檢測要求[29]。

3.1.1 高效液相色譜法

HPLC常用於分離和分析化學混合物，帶有半確認的性質，是目前多數獸葯殘留的常規分析手段。我國農業部2004年頒布的中華人民共和國農業行業標準NY/T 918-2004中使用高效液相色譜法測定飼料中色譜儀主要由高壓輸液泵、色譜柱、檢測器等部件組成，樣品各組分溶於液體流動相，經高壓輸液泵泵入系統，經過色譜柱時，各組分由於與固定相發生作用的大小強弱不同，因此在固定相中滯留時間不盡相同，從而達到分離的目的。進樣、洗脫、檢測等自動化的可行性，以及各種性能的色譜柱和不同種類的檢測器，在某種程度上促進了HPLC作為快速篩查技術的使用，然而其測定的靈敏度以及選擇性限制了更深入的應用。

JIANG等[31]所改進的HPLC體系中，以丙烯酸為單體熱聚合併與乙二醇甲基丙烯酸酯交聯形成非共價的分子印跡聚合物(molecularly imprinted polymers,MIPs)作為固相吸附劑，以E2作為 MIP的模板分子，利用優化的分子印跡固相萃取(MISPE)從魚蝦組織中提取E2。其表現出對E2的高度選擇性，在對魚蝦組織中的E2檢測時，加標回收率高達84%±6.53%，因能消除基質的干擾，比傳統固相萃取高出60%左右，檢測限(LOD)可達0.023 mg/L，定量限(LOQ)相當於0.076 mg/L，線性檢測範圍在0.01～2.0 mg/L。HU等同樣以E2作為MIP模板，結合固相微萃取應用HPLC檢測水產品中的E2，檢出限範圍為0.9～2.39 μg/L，對魚類的加標回收率達80.0%～83.6%，對蝦類的回收率達85.0%～94.1%[32]。

3.1.2 色譜-質譜聯用法

氣相色譜作為柱色譜法則是以惰性氣體為流動相，以具有一定活性並且表面積大的吸附劑作為固定相，依據對混合物中各組分的吸附力不同而達到分離的目的，由於樣品在氣相中傳遞速度快，另外可選做吸附劑的物質較多，因此是一種快速分析和高效分離的分析方法。

質譜儀(MS)是稱量離子的「天平」，以分析離子電荷-質量比達到鑒定物質的目的，操作時使試樣中各組分在離子源處電離形成帶正電荷的離子，經電場加速形成電子束，再經由質量分析器得到質譜圖，進而通過庫檢索定性定量，如今的質譜技術已具有相當的高靈敏度掃描和非目標篩選。

在GC-MS中，試樣經色譜柱分離後進入質譜儀，再經過質量分析器、檢測器後，即成為質譜儀號輸入計算機。色譜的分離和質譜數據的採集卻是同時進行的，因其樣品用量少，分離和鑒定可同時進行，加上具有高解析度、高準確度、高靈敏度和較寬的動態範圍而被廣泛應用，現一般用於最後檢測的確證。國標GB/T 22967—2008中使用氣相色譜-負化學電離質譜法測定牛奶和奶粉中雌二醇殘留量，牛奶中檢出限達0.25 μg/kg，奶粉中為2 μg/kg[33]。ZOU等[34]在用GC-MS測定魚蝦組織中E2時，固相萃取清理後，線性檢測範圍為0.005～0.25 μg/mL，加標回收率在68.5%～100.1%之間，LOD達0.2 μg/kg。

近年來不斷通過研發使用不同的MIP作為色譜儀的固相萃取吸附劑(solid phase extraction.SPE)，來提高SPE的選擇性與凈化水平，從而增強檢驗的準確性、靈敏度與精密度。如DU等建立了一種基於虛擬模板MIP的LC-MS分析法，對豬肉中的瘦肉精進行了選擇性分析，檢測限可達0.02 mg/kg[35]。YANG等採用一種新型的分子印跡聚合物作為LC-GC/MS的SPE取代傳統的固相萃取柱(Oasis HLB)來提取飲料和罐頭中的雙酚A類似物，該方法在飲料中的定量限範圍在2～150 ng/L，檢測罐頭時的定量限為0.03～1.5 mg/kg[36]。MIP曾使用多種納米材料作為表面塗料，包括二氧化硅納米粒子、量子點和磁性納米粒子，DU等使用乙烯化多壁碳納米管作為GC/MC MIP-SPE的表面塗料，測定飲料中的鄰苯二甲酸酯時檢測限達2.3 ng/L[37]。

這種MIP獨特的高效選擇性分析以及相應的靈活性，應用於HPLC、GC-MS或是LC-MS時可用於測定複雜樣品基質，對於檢測E2是一種強大的助力，JIANG[31]和HU[32]都是把E2作為MIP模板模擬生物識別，再結合固相微萃取進行HPLC檢測。然而每種方法都具有一定的局限性，由於MIP結構和形狀的兼容性，得到的固相微萃取纖維對E2結構類似物也表現出一定的選擇性。

3.2 生物分析法

3.2.1 重組基因酵母篩檢法

重組基因酵母篩檢法(yeast estrogen screen,YES)是早年建立的評價環境雌激素(environmental estrogens,EEs)活性的常用方法[38]，應用重組基因酵母檢測樣品，將人雌激素受體DNA序列穩定重組於酵母染色體，同時酵母細胞含有編碼β-半乳糖苷酶Lac-Z基因的表達質粒，當雌激素活性物質激活酵母中的雌激素受體基因響應片段，β-半乳糖苷酶相關基因也相應的被激活與表達，共同開始蛋白質的轉錄和合成過程，因此β-半乳糖苷酶活性的強弱與待測的雌激素活性呈正相關。由於該檢測法操作簡單快速、靈敏度高、特異性強，酵母細胞易於培養且費用低廉，可用於大批量樣品的篩查。GAIDO等[39]研究人員在1997年首次建立重組基因酵母測評體系，對E2的檢測靈敏度可達到10-12mol/L。COMTOIS等[40]以YES試驗分析城市污水中的環境雌激素成分比例含量，其建立的E2檢測體系檢測限達1.4 ng/L，其中對污水中的E2直接檢測，當量濃度線性範圍為4.4～72 ng/L，由於YES能同時處理大量的樣品並只需污水過濾後便能直接測定，使得這檢測體系便於推廣以及。

3.2.2 人乳腺癌細胞增殖實驗

人乳腺癌細胞(MCF-7)含有許多雌激素調節基因，當受試物接種於不含有血源性雌激素的培養基中，外界的刺激可使MCF-7細胞產生相關蛋白，這種相關蛋白的表達可評價樣品的雌激素活性[41]。OKUBO等[42]以雌激素受體依賴型MCF-7細胞增殖試驗檢測了20種用於殺蟲劑或除草劑的農藥的雌激素活性，其中以30 pmol/L E2作為參考系刺激MCF-7細胞增殖，並添加100 nmol/L的雌激素拮抗劑作為增殖阻斷劑；LEE等[43]在為絕經期婦女尋找雌激素替代療法時就以MCF-7細胞增殖試驗來檢測野生植物中雌激素的活性，同樣以100 nmol/L的雌激素拮抗劑做阻斷，研究顯示能刺激MCF-7細胞增殖的E2濃度為10 μg/mL。由於MCF-7細胞及培養基中的血清均來自人體，其結果可以排除由動物實驗外推到人的不確定性，結果可信度較高，方法簡單快速，適用於大規模篩選。然而細胞培養成本過高且對實驗條件要求也較高，同時受許多因素的影響，如不同細胞株的敏感程度、培養條件等都會導致實驗結果出現差異[44]。

3.3 免疫分析法

免疫學分析法是利用抗原抗體特異性結合反應特性的分析方法，主要包括RIA和目前檢測肉品及乳品中獸葯殘留的免疫學檢測方法中應用最多的酶聯免疫分析法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)。

3.3.1 放射免疫分析法

RIA是利用同位素標記抗原與樣品中待檢測的物質，同相對應的抗體發生競爭性抑制反應，從而達到檢測目的的痕量檢測方法。RIA同時具有免疫反應的高特異性和放射性測量的高靈敏度，應用範圍廣范。據不完全統計，目前至少已有300多種生物活性物質建立了RIA，幾乎可應用於所有激素的分析(包括多肽類和固醇類激素)，同時也用於病毒抗原、腫瘤抗原、細菌抗原等各種蛋白質和藥物的分析，其應用範圍還在不斷擴展。早年WOLFORD等[45]運用RIA檢測商業化牛奶中E2的濃度能達到6.4 pg/mL。然而RIA用到的放射性試劑對人體有害，樣品處理過程中會帶來一系列的問題隱患，加上其穩定性受多種因素影響，需要有一整套質量控制措施來確保結果的可靠性，在獸葯殘留分析檢測領域已逐漸被ELISA所替代。PAPE-ZAMBITO D等現以RIA檢測法檢測到商品牛奶中E2的平均含量在0.4～1.1 pg/mL[7]。

3.3.2 酶聯免疫分析法

ELISA是把酶的高效催化作用和抗原抗體免疫反應的特異性有機結合起來的一種檢測技術，操作簡便、靈敏度高、特異性強，適合大量樣品的篩選。將抗原或抗體吸附於固相載體上進行免疫酶反應，經過底物顯色後用酶標儀進行檢測，可同時進行大批量樣品檢測，現已廣泛應用於獸葯殘留檢測分析的快速篩選。周虹等以市場現有ELISA試劑盒檢測了3種品牌的市售牛奶，測得E2平均濃度在24.6 pg/ml[8]。WANG等[46]以ELISA檢測牛奶中的紅霉素，從製作紅霉素半抗原開始，一步步從免疫到製備單克隆抗體，最後建立完整的紅霉素檢測體系，與製備E2ELISA檢測試劑盒異曲同工，因此若市場需要完全可以製備靈敏度更高的試劑盒來應用市場。

3.4 熒光適配體分析法

適配體-熒光共振能量轉移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)是利用核酸適配體特異的分子識別功能，以及特定熒光基團之間的能量轉移建立的一種高靈敏度、高選擇性的光譜方法。

核酸適配體主要應用單鏈寡核苷酸片段，以其莖環二級結構使核酸分子形成多種三維結構，由於其容易製備及修飾，穩定性高，與一些小分子靶物質以及DNA、RNA、蛋白質等特異性結合力強，親和力高，常被用於製作各種適配體感測器。在FRET法中，由於供體基團的熒光發射譜與受體基團的吸收光譜有一定重合，當距離合適時便可觀察到供體熒光猝滅和受體熒光增強。

蔣曉華等[47]以雌二醇適配體作為供受體之間的連結媒介，供受體是能與適配體鹼基互補配對的兩條互補鏈，當適配體檢測到E2時，由於高選擇性，適配體與E2優先結合，而原先發生熒光能量轉移的供受體重新遊離，使得供體重新發出熒光，基於此特性建立高靈敏度的E2檢測方式，其線性範圍在1.0×10-11～5.0×10-9mol/L，對人尿液中E2的LOD可達6×10-12mol/L。

4 結論與展望

E2是乳腺癌等雌激素依賴性癌症疾病的重要致癌風險因素，食源性E2在動物源食品中的殘留關乎人類的健康和生存發展，對動物源食品中的E2進行殘留監控是一個複雜的系統工程，其中檢測技術起著舉足輕重的作用，是「管出來」的重要技術支撐。當前在動物源食品安全檢測領域，一般採用的 「快速篩選+定量確證」的檢測模式，即針對大批量樣本首先採用免疫分析進行快速篩選，疑似陽性樣本採用儀器分析方法進行確證。這種檢測模式高效、經濟、快速，是全世界通用的動物源食品安全監控模式。我國已經發布了多個動物性食品E2殘留的國家(行業)檢測標準，如GB 29698—2013以GC-MS作為奶及奶製品中E2殘留量測定的檢測標準[48]，農業部958號公告10—2007中GC-MS法對水產品中E2殘留量的測定[49]；進出口商品檢驗行業標準SN 0664—1997中以RIA對出口肉及肉製品中雌二醇殘留量的檢測等[50]，基本滿足了定量確證檢測技術的需求，再加上新型技術MIP這類萃取技術的不斷應用與更新，使確證檢測技術靈敏度與高效性不斷強化。當前我國畜牧養殖業生產分散經營依然佔有較大比重，動物源食品生產、加工主體80%以上是小微企業，定量確證技術需要大型分析儀器和熟練的技術人員，難以滿足大量樣本快速檢測的要求，同時由於動物源食品的鮮活特性，其檢測的關口主要在屠宰場、超市、農貿市場、鮮奶收購站和進出口岸等，往往需要實時、現場檢測。2015年修訂的《食品安全法》明確要求食品安全監控要延伸到鄉鎮一級。隨著國家、社會和消費者對食品安全監管的要求日益提高，樣品抽檢比例必然增大(當前不到1%)，需要檢測樣本數量將大幅增加，這就要求在未來的E2監控中，需要面對大量、痕量污染的樣品，因此與發達國家相比，我國對快速檢測具有特殊的需求，發展檢測速度快、檢測靈敏度高和檢測準確的快速檢測技術是E2殘留檢測的重點研究方向。

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Research progress on risk and detection technology ofestradiol residues in food

BAI Yu1,HU Jing-yan1,ZHANG Jing2*

1(Wenzhou Vocational College of Science and Technology,College of Animal Science,Wenzhou 325006,China) 2(Wenzhou Academy of Agricultural Sciences,The Ministry of Agriculture of Agricultural Products Quality Safety Risk Assessment Laboratory,Wenzhou 325006,China)

ABSTRACTAs a female sex hormone,estradiol (E2) is a most important form of estrogen in humans and animals,it triggers the reproductive system development during the puberty,which is involved in a number of physiological processes,including development of the female reproductive structures and secondary sexual characteristics.E2is a typical natural estrogen used extensively in livestock for promotion of their growth.It is now widely exist in the environment and caught many attention by scientists due to the biological estrogen effects which can cause carcinogenicity.Therefore,in order to ensure food safety and human physiological health,it has very important to monitor and control the estradiol residues in food source and improve detection technology.The main residual sources,hazard analysis and detection techniques of food source E2were discussed in order to provide a reference for E2biological activity research and convenient and effective detection techniques establishment.

Key wordsestradiol; residual risks; potential carcinogenicity; detection techniques

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014216

基金項目：浙江省科技廳公益性項目(2014C32046、2017C37087)；溫州市科技局公益性項目(S20150026、N20140042)

收稿日期：2017-03-05，改回日期：2017-05-17

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