一作解讀：紫粒小麥中調控花青素合成轉錄因子的克隆與功能解析

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本期作者：蔣文慧

近日，JXB雜誌在線刊發了題為「Two Transcription Factors TaPpm1 and TaPpb1 Co-Regulate the Anthocyanin Biosynthesis in Purple Pericarp of Wheat」的研究論文，由西北農林科技大學的王中華教授團隊完成，王中華教授和高欣副教授為共同通訊作者，我們特邀請了文章的第一作者蔣文慧來為我們解讀這篇文章，以饗讀者。

花青素是一類抗氧化物質，紫粒小麥果皮所含有的天然花色苷能清除細胞中自由基，在促進人類身體健康和預防心血管疾病中起重要作用。此外，花青素所引起的紫色表型可作為育種中有效的形態學標記，因此，研究小麥籽粒花青素合成的分子機制具有重要意義。前人研究表明，籽粒花青素合成是由2個基因共同調控的，分別被定位於7D（Pp-D1）與2A染色體（Pp3）上，且推測其分別為MYB與bHLH轉錄因子(Khlestkina, 2013)。張懷剛研究員及其團隊對2A染色體長臂上的基因TaMYC1（Pp3）進行了克隆，並找到了其變異類型（TaMYC1w與TaMYC1p），基因沉默進一步證明了該基因在紫粒花青素合成中不可或缺的作用(Zonget al.,2017)（介紹一篇發表在Front. Plant Sci. 上有關小麥籽粒顏色研究的論文）。

本研究通過對黑小麥76不同時期及處理的紫色與白色果皮樣品進行轉錄組測序（圖1A），進化樹分析其轉錄組中編碼MYB與bHLH的蛋白，篩選到了3個與花青素調控相關的MYB基因（TaPpm1、TaPpm2與TaPpm3）和1個bHLH基因（TaPpb1，與TaMYC1為同一個基因）（圖1B）。通過與小麥全基因組資料庫（Triticum_aestivum.TGACv1）進行比對，將TaPpm1、TaPpm2、TaPpm3和TaPpb1分別定位到7DS、4BL、4DL和2AL上。TaPpm1（7DS）與TaPpb1（2AL）的染色體位置與之前定位的花青素調控位點（Pp-D1與Pp3）相同，且TaPpm1與TaPpb1的時空表達與花青素的積累模式一致（圖2），故選擇這兩個基因作為籽粒花青素調控的候選基因，並對其功能進行了進一步解析。

圖1：轉錄組測序樣品及MYB與bHLH的進化樹分析

A用於轉錄組測序的3份黑小麥76籽粒樣品，H-10d與H-17d分別為小麥開花後10 d，17 d的樣品，H-10p為花後10 d，去掉穎殼後照光12 h的樣品；B.基於轉錄組測序結果的MYB與bHLH的進化樹分析。

圖2：轉錄因子基因的時空表達模式

ATaPpm1/2/3與TaPpb1在A14與黑小麥76不同組織中的表達；BTaPpm1/2/3與TaPpb1在種子發育不同時期的表達模式。

基因在序列上的變異常引起其功能的改變，因此該研究對紫粒與非紫粒品種中TaPpm1與TaPpb1進行了擴增測序，結果顯示，TaPpm1由於編碼區存在不同的插入突變，形成4種類型的等位變異（TaPpm1a/b/c/d）（圖3A）；而TaPpb1的編碼區在不同品種中是相同的，啟動子區存在2種等位變異（TaPpb1a與TaPpb1b），其中，TaPpb1a的啟動子中存在多個261 bp的重複單元，而TaPpb1b中只存在1個單元（圖3B）。供試的四個紫色品種都表現為TaPpm1a與TaPpb1a的基因型，其它突變類型則分布於非紫粒品種中（圖3C）。

圖3：TaPpm1與TaPpb1序列的等位變異及其在不同材料中的分布

ATaPpm1編碼區的四種等位變異；BTaPpb1啟動子區的兩種變異類型；CTaPpm1與TaPpb1在不同籽粒顏色材料中的基因型分布。

為了檢測TaPpm1與TaPpb1的變異是否與紫粒表型存在關聯性，將白粒品種A14（TaPpm1d/TaPpb1b）與紫粒品種H76（TaPpm1a/TaPpb1a）進行雜交，統計F2單株的籽粒表型及TaPpm1與TaPpb1的基因型。結果顯示，126個F2代單株中，紫粒與白粒的分離比符合9:7，說明籽粒顏色由2個基因共同調控，其中，68個紫粒單株中同時存在TaPpm1a與TaPpb1a基因，而58個白粒單株中，TaPpm1a與TaPpb1a基因不會同時存在（圖4A）。

為了進一步探究這兩個基因在花青素調控中的作用，採用雙熒光素酶試驗檢測TaPpm1s與TaPpb1對下游花青素結構基因ANS的調控，結果顯示，只有在TaPpm1a與TaPpb1共同存在時，ANS啟動子能夠被激活；TaPpm1a與TaPpb1單獨存在或者突變類型TaPpm1b與TaPpb1共同存在均不能激活ANS表達（圖4B），說明在調控花青素結構基因表達中，TaPpm1a與TaPpb1缺一不可。

圖4：TaPpm1、TaPpb1在F2群體中的基因型分布及其對花青素結構基因的調控

ATaPpm1與TaPpb1在F2群體中的基因型分布；B TaPpm1s與TaPpb1的不同組合對花青素結構基因的調控作用。

前人研究表明，花青素合成往往需要轉錄因子MYB、bHLH互作進行共同調控(Hichriet al.,2011)。為了探究TaPpm1基因編碼區序列的改變對其蛋白功能的影響，利用酵母雙雜交試驗，檢測了TaPpm1的4種變異類型與TaPpb1的互作情況，結果顯示，TaPpm1的序列變異直接影響了其編碼蛋白與TaPpb1蛋白的互作，即TaPpm1a與TaPpb1的互作強烈，而TaPpm1b與TaPpb1的互作減弱，TaPpm1c/d則不能夠與TaPpb1發生互作（圖5A）。

為了檢測TaPpb1不同啟動子作用強弱，將TaPpb1兩種類型的啟動子分別連接到熒光素酶基因LUC的上游，TaPpb1a的啟動子能夠啟動LUC基因的大量表達，而TaPpb1b則不能（圖5B），這說明TaPpb1中啟動子區的插入，能夠增強TaPpb1的表達，這與蘋果花青素調控基因MdMYB10中啟動子區插入的重複序列功能相似(Espleyet al.,2009)。

圖5 TaPpm1s與TaPpb1的互作及TaPpb1啟動子的激活功能

A酵母雙雜檢測TaPpm1不同變異類型與TaPpb1的互作效應；BTaPpb1兩種啟動子對下游基因的激活功能

綜上所述，本研究結果證明，小麥紫粒的形成受MYB基因TaPpm1與bHLH基因TaPpb1的共同調控。其中，TaPpm1的突變會影響其編碼蛋白與TaPpb1的結合，從而使得MYB-bHLH複合體不能產生而阻止花青素的合成，而TaPpb1啟動子區的變異直接影響了其基因表達量，在只有一個261 bp單元時，其表達量很低，不能產生足夠量TaPpb1，導致MYB-bHLH複合體減少，最終得到無花青素積累的小麥籽粒。本文找到了花青素調控的兩個基因，從序列變異的角度解釋了這兩個基因對花青素合成的影響，開發的標記可用於後續育種中對紫粒性狀的選育。

參考文獻：

Espley RV, Brendolise C, Chagne D, Kutty-Amma S, Green S, Volz R,Putterill J, Schouten HJ, Gardiner SE, Hellens RP, Allan AC. 2009. Multiplerepeats of a promoter segment causes transcription factor autoregulation in redapples.Plant Cell21, 168-183.

Hichri I,Barrieu F, Bogs J, Kappel C, Delrot S, Lauvergeat V.2011. Recent advances in the transcriptional regulation of the flavonoidbiosynthetic pathway.Journal ofExperimental Botany62,2465-2483.

KhlestkinaEK. 2013. Genes determining thecoloration of different organs in wheat.RussianJournal of Genetics: Applied Research3,54-65.

Zong Y, XiX, Li S, Chen W, Zhang B, Liu D, Liu B, Wang D, Zhang H.2017. Allelic variation and transcriptional isoforms of wheat TaMYC1 gene regulatinganthocyanin synthesis in pericarp.Frontiersin Plant Science8.

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