手把手教你玩轉腫瘤自噬研究！

轉載請註明：解螺旋·臨床醫生科研成長平台

自噬作為細胞內「清道夫」，已經廣為人知。但是自噬在腫瘤領域中似乎「亦正亦邪」，有時它可啟動II型程序性死亡，讓腫瘤細胞「一命歸西」，有時卻又能提高腫瘤細胞對應激的耐受能力，使其「死中求生」。因而，自噬與腫瘤之間的「恩恩怨怨」引得科研界的一眾研究者紛紛化身「娛記」，力爭挖得第一手「八卦」進行爆料。

其實，自噬就是一把雙刃劍，對腫瘤存在促進與抑制雙重作用。而這一特性也為腫瘤防治提供了兩種截然不同的思路：抑制自噬——提高抗癌治療效果，或激活自噬——誘導腫瘤細胞發生自噬性死亡。即便如此，兩種研究思路的實驗研究卻是相似的，可以說是殊途同歸，小魚這就將自噬腫瘤研究的一個入門級參考模板分享給大家。

那麼為了更好地玩轉自噬研究，小魚將簡單介紹上述研究流程中必備基本工具及實驗策略，可使你的實驗研究變得事半功倍。

自噬中常涉及的信號通路

正常培養的細胞自噬活性非常低，不便於觀察。此時，則可用相應試劑對細胞進行誘導，其後8 min內即可觀察到自噬體形成，2h後自噬溶酶體基本降解消失。通常這些試劑是自噬相應信號通路的抑製劑或促動劑，而目前比較肯定的自噬信號通路可大致分為以下3類。

1.抑制類信號通路：1）在Class I PI3k pathway（PI—phosphatidylinositol，磷脂醯肌醇）中，當血糖水平高時，可接收胰島素受體傳來的信號，進而抑制自噬作用。2）依賴mTOR途徑的自噬，如PI3K-AKT-mTOR信號通路和AMPK-TSC1/2-mTOR信號通路。

2.激活類信號通路：在Class III PI3K通路中，beclin1和UVRAG作為正調控子，抗凋亡因子bcl-2作為負調控子共同參與調控自噬。其結構上類似於Class I PI3K，但作用卻完全相反。

3.其他信號通路：GTP結合的G蛋白亞基Gαi3抑制自噬；GDP結合的Gαi3蛋白活化自噬。死亡相關蛋白激酶（death-associated protein kinase,DAPK）和DAPK相關蛋白激酶（DAPK-related protein kinase-1,DRP-1）可誘導自噬。

自噬研究相關基因（ATG）

除此之外，一般還需結合遺傳學技術對自噬相關基因（ATG）進行干預：包括反義 RNA 干擾技術（Knockdown）、突變株篩選、外源基因導入等，以便鑒定自噬相關蛋白。由於自噬研究的歷史關係，很多基因在酵母和哺乳動物中有不同的命名，具體見下表。

同時，小魚也會列出幾個新近發現的ATG基因：

1）bif-1（Endophilin B1） 和 UVRAG（ultraviolet irradiation resistance-associated gene）：蛋白bif1可通過UVRAG蛋白與Beclin1形成複合物，調節自噬和腫瘤形成。

2）VMP1 （Vacuole membrane protein 1）可促使哺乳動物細胞中自噬小體的形成。

3）DRAM （damage-regulated autophagy modulator）：自噬過程中P53誘導的調節子，在細胞凋亡中起著重要的作用。

4）TP53INP2 （Tumour Protein 53 Induced Nuclear Protein 2）可促使哺乳動物細胞中自噬小體的形成。

自噬的觀察與檢測

細胞經誘導或抑制後，需對自噬過程進行觀察和檢測。目前，人們對自噬的檢測主要包括基於檢測自噬體的直接(觀察自噬體的形態)和間接(檢測自噬體表面蛋白標記)的方法。

1.電鏡下觀察自噬體的形態

在電鏡下可觀察到呈新月狀或杯狀、雙層或多層膜、有包繞胞漿成分的趨勢的自噬囊泡（autophagic vacuole，AV）。

自噬體（AVi）的特徵為：雙層或多層膜的液泡狀結構，內含胞漿成分，如線粒體、內質網、核糖體等。

自噬溶酶體（AVd）的特徵為：單層膜，胞漿成分已降解。

2. 在熒光顯微鏡下採用 GFP-LC3 融合蛋白來示蹤自噬形成

LC3融合蛋白可分為以下兩個體系。

*GFP-LC3單熒光指示體系：利用了LC3在自噬形成時聚集的原理，即無自噬時，GFP-LC3 融合蛋白彌散在胞漿中；自噬形成時，GFP-LC3 融合蛋白轉位至自噬體膜。在熒光顯微鏡下形成多個明亮的綠色熒光斑點，一個斑點相當於一個自噬體，可以通過計數來評價自噬活性的高低。

但是綠色斑點增多並不一定代表自噬活性增強，也有可能是自噬溶酶體降解途徑受阻，可以通過western blot 檢測遊離的GFP、p62來驗證（P62與LC3呈負相關的關係）。其中，P62可以反映自噬的強弱。當LC3 II升高，P62同時降低，表明自噬流通暢；如果LC3II升高，P62升高，表明自噬起始正常，但下游不通，吞噬體和溶酶體不能融合。

*mRFP-GFP-LC3雙熒光自噬指示體系：用於標記追蹤LC3以及自噬流的變化。其中GFP是酸敏感型GFP蛋白，而mRFP是穩定的熒光表達基團。當自噬溶酶體形成後，其內部的酸性環境，可使GFP淬滅。

因此GFP的減弱可指示自噬溶酶體形成的順利程度，則可通過GFP與mRFP的亮點比例來評價自噬流進程。其中紅綠熒光merge後出現的黃色斑點就只是自噬體，而紅色的斑點指示自噬溶酶體。如吞噬體和溶酶體能正常融合，那麼紅色熒光多於黃色熒光，如自噬下游阻滯，吞噬體和溶酶體不能正常融合，則主要為黃色熒光。

3. 通過Western blot檢測 LC3-II/I 比值的變化以評價自噬形成

在自噬（Autophagy）形成過程中，胞漿中的微管相關蛋白輕鏈3（MAP-LC3）會酶解掉一小段多肽形成LC3-I，LC3-I跟磷脂醯乙醇胺即腦磷脂(PE)結合轉變為（自噬體）膜型（即LC3-II），因此，LC3-II/I 比值的大小可估計自噬水平的高低。

又因LC3 抗體對 LC3-II有更高的親和力，會造成假陽性。所以方法 2和3需結合使用，同時需考慮溶酶體活性的影響。

4. MDC染色&CellTrackerTM Green 染色

前者即單丹磺醯屍胺染色，而後者主要用於雙染色。兩者均能染細胞的液泡，均屬於非特異性染色。

自噬相關蛋白定位

在研究自噬相關蛋白時，需對其進行定位。為了區分自噬體與溶酶體、線粒體、內質網、高爾基體等細胞器，常用一些示蹤蛋白在熒光顯微鏡下來共定位：

Note：這些蛋白均為胞漿蛋白，爬片或胰酶消化的細胞在做免疫熒光前需先透膜（permeablize），可採用 0.1% SDS 處理。

最後奉上一張自噬機製圖給大家，相關的分子作用可以說非常清楚了。

喜歡這篇文章嗎？立刻分享出去讓更多人知道吧！