耳鼻咽喉-頭頸外科「圖解」206-73-分子生物學與基因治療基礎

圖-1. 基因表達涉及的基本步驟。 基因通過RNA聚合酶在核內複製，導致產生互補的RNA鏈。 這被處理以產生信使RNA（mRNA），其離開細胞核並經由核糖體「翻譯」以形成蛋白質產物。

圖-2. 所顯示的是細胞周期的各個階段，其通常在動物中持續10至25小時。 G1最長也是最可變的階段，範圍可以從4到24小時不等。 M階段只用了1個小時。 還描繪了細胞周期的調節，其中許多元件是基因和分子治療的目標。 Cdk，細胞周期蛋白依賴性激酶。

圖-3. RNA干擾的機制。 用於RNA干擾的效應分子是短干擾RNA（siRNA），其可以由長雙鏈RNA（dsRNA）的內源性產生; 然後由Dicer處理以產生siRNA（灰色箭頭）。 或者，可以通過直接注射將合成的siRNA引入細胞中，而不需要Dicer（虛線箭頭）。 或者，可將編碼短夾RNA（shRNA）的質粒或病毒載體引入細胞（虛線箭頭）。 然後用Dicer處理shRNA以產生siRNA（灰色箭頭）。 無論生產途徑如何，siRNA都會激活RNA誘導的沉默複合物（RISC），然後「信任」信使RNA（mRNA）序列，該序列與反義siRNA「引導鏈」（黑色）箭頭）。 然後mRNA被切割，並且不產生基因產物，有效地「壓制」該基因。

圖-4. 基因治療的體細胞靶點。 許多不同的細胞類型是基因治療的潛在目標。 實線箭頭代表目前在人體臨床試驗調查下的組織靶標; 虛線箭頭代表動物模型中正在研究的目標。 目前的基因治療實驗室和臨床研究明確排除對生殖細胞（精子和卵子）的操縱，這可能會將基因傳給後代。

圖-5. 質粒DNA載體的示意性結構，即編碼治療性基因產物的DNA的環狀分子。 DNA載體含有實現治療水平基因產物表達所需的特殊元件。 啟動子區和增強子區調節質粒DNA轉錄成RNA，特定處理元件調節RNA翻譯成蛋白質。 DNA載體可以與增強載體攝取或提供細胞攝取特異性的蛋白質，脂質或合成有機化合物複合。

圖-6. 構建複製缺陷型逆轉錄病毒載體。 A，莫洛尼白血病病毒基因組編碼三種多蛋白-gag，pol和env-它們一起構成逆轉錄病毒顆粒。 gag和pol基因編碼逆轉錄病毒的內核以及感染靶細胞後處理逆轉錄病毒基因所需的酶。 env基因形成病毒的外膜並識別靶細胞上的特異性受體。使用幾種重組基因製備有缺陷的逆轉錄病毒載體：一種表達gag-pol多蛋白，一種編碼env蛋白，一種含有與兩種LTR（啟動子和增強子）序列結合的治療基因和psi（包裝）序列。 B，包裝細胞系表達來自A中所示構建體的gag，pol和env。當含有具有LTR和psi序列的治療性基因的載體被引入該細胞時，非病原性病毒顆粒將從gag ，pol和env蛋白;該產生的病毒顆粒能夠通過感染過程將治療序列攜帶入細胞中。 (From O』Malley BW Jr, Ledley FD. Somatic gene therapy. Methods for the present and future. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 1993;119:1100. Copyright 1993, American Medical Association.)

圖-7. 構建複製缺陷型腺病毒載體。 A，使用缺失E3基因的缺失的腺病毒基因組以及產生增殖性腺病毒顆粒所需的E1基因構建腺病毒載體。 將重組基因插入E1基因的位點。 B，在能夠表達E1的293細胞系中產生腺病毒顆粒，因此能夠將僅包含重組病毒基因組的病毒顆粒與治療基因組裝。 (From O』Malley BW Jr, Ledley FD. Somatic gene therapy. Methods for the present and future. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 1993;119:1100. Copyright 1993, American Medical Association.)

圖-8. 基因的轉移可以通過幾種不同的遞送機制來實現。 基因轉移最初是在肌肉中使用直接注入肌肉的裸露DNA進行描述的（1）。 這通常被認為是低效率的基因轉移方法，但可能對DNA疫苗接種策略的開發非常有用。 包裝成病毒載體（2）允許最有效的基因轉移，但與安全問題有關。 非病毒載體技術（3）涉及塗布或濃縮基因構建體以允許容易地進入細胞。 它比病毒載體介導的基因轉移效率低，但被認為更安全。 所有基因遞送的最後共同途徑是產生導致細胞表型改變的蛋白質。 正在開發的替代基因治療策略使用抑制性RNA來降低某些基因的表達。 mRNA，信使RNA。

圖-9. 離體和體內基因治療策略。 基因治療的體內策略涉及通過常規注射途徑（紅色箭頭）將DNA或病毒載體直接施用於患者。 體外策略包括從患者體內取出組織，在培養物中生長細胞，在實驗室中將基因導入這些細胞，然後通過自體移植（藍色箭頭）將遺傳修飾的細胞返回給患者。 (From O』Malley BW Jr, Ledley FD. Somatic gene therapy. Methods for the present and future. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 1993;119:1100. Copyright 1993, American Medical Association.)

圖-10. 基因治療癌症的策略。 已經描述了通過基因療法治療癌症的幾種不同的策略。 這些包括在腫瘤細胞內表達細胞因子如白細胞介素-2以增強針對腫瘤特異性抗原的免疫應答; 引入外來移植抗原例如HLA-B7以誘導免疫排斥; 將細胞因子導入腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL細胞）以增強其細胞病變效應; 並引入諸如皰疹TK等基因以使腫瘤細胞對諸如阿昔洛韋或更昔洛韋等藥物敏感。 (From O』Malley BW Jr, Ledley FD. Somatic gene therapy. Methods for the present and future. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 1993;119:1191. Copyright 1993, American Medical Association.)

上期：耳鼻咽喉-頭頸外科「圖解」206-72-氣管、支氣管內窺鏡

參考：Cummings Otolaryngology - Head and Neck Surgery, 6E