學術前沿∣「三位一體」模式助力尿路上皮癌精準免疫
楔子
由於兩年來臨床專家、藥廠、檢測公司等以不同方式、在不同場合提供給腫瘤患者最前沿的免疫檢查點抑製劑（ICB）訊息，使得大部分腫瘤患者用ICB之前都會諮詢能不能做常規四項指標，即PD-L1表達/CD8+T細胞狀態/腫瘤突變負荷（TMB）/微衛星不穩定性（MSI）, 作為使用/不使用ICB的參考依據。問題是這四個指標只能揭示冰山的一角，而無法一覽眾山小。
因此，無論是去年ASCO還是今年CSCO-IO都提出了更高的目標-精準和聯合，這就督促大家在兩個方面進行更多探索工作，發現新的預測標誌物，聯合使用已成熟的預測標誌物，最終構建基於大數據分析/AI輔助判定預測分析模型。前不久發表於《Nature》的一篇論文，不僅發現了TGFβ表達與尿路上皮癌療效負相關，而且提出了」三位一體」的理論預測模型[圖1]。
圖1：「三位一體」模型預測尿路上皮癌ICB療效
[1]
無獨有偶的是同時期的《Nature Communication》發表了一篇關於ICB+TGFβ的雙功能抗體（Y-traps）的研究論文[圖2]，相比於ICB單葯或者ICB +TGFβ聯合治療，Y-traps體現出了較大的療效優勢。這說明腫瘤免疫整體化分析，不僅會使得免疫治療走上精準化大道，而且會為藥廠提供更多在真實世界中驗證過的可靠靶點。
圖2： Y-traps抗體的結構示意圖
[2]
這篇小文會重點闡述下《Nature》文中的主要結論，並講述一些體外試驗治療的結果，大家帶著邊學習邊批判的科學態度進行閱讀，以期大家對於腫瘤免疫精準化有更為深層次的思考。
01
入組情況及研究目的
這個研究納入Atezolizumab單抗治療尿路上皮癌的II期臨床試驗（IMvigor210）患者，分別就其DNA層面(WES/FMOne)、RNA層面（RNA-seq）、蛋白層面（Immune phenotype）進行「三位一體」預測分析[圖3]，從而構建預測尿路上皮癌患者ICB療效的綜合分析模型。
圖3：研究入組及其相關檢測匯總
[3,4]
2
DNA層面標誌物
1、腫瘤突變負荷（TMB）
通過全外顯子測序（WES）/PANEL測序（FMOne）分析入組患者腫瘤組織的TMB發現， 緩解患者（CR/PR）相較未緩解患者（SD/PD）有更高的TMB，而且TMB與總體生存時間正相關[圖4]。
圖4：TMB與Atezolizumab療效正相關
[1]
2、腫瘤新抗原負荷（TNB）
通過分析TMB的衍生指標TNB發現，緩解患者相較未緩解患者有更高的TNB，TNB上四分位患者相較其他三組患者顯著性有更長的OS [圖5]。
圖5: TNB與Atezolizumab療效正相關
[1]
3、DNA損傷修復（DDR）相關基因
DDR基因突變（TP53除外）在尿路上皮癌患者中約佔20%，將DDR基因突變與TMB進行關聯性分析，發現兩者正相關，DDR基因突變患者相較未突變的患者有更好的客觀緩解率（ORR）[圖6]。
圖6: DDR相關基因突變與Atezolizumab的ORR正相關
[1]
3
RNA層面標誌物
1、表達信號通路
通過RNA-seq檢測入組患者腫瘤組織的RNA表達，比較緩解和未緩解患者的基因表達差異，從而獲得與緩解正相關信號通路，如DNA修復、細胞周期、范可細胞因子及其受體通路尼貧血等信號通路，而與緩解負相關的唯一信號通路是細胞因子及其受體信號通路 [圖7]。
圖7：基因表達差異信號通路富集分析
[1]
2、TGFB1/TGFBR2基因
對於細胞因子及其受體信號通路進行進一步分析發現，TGFB信號通路相關的兩個基因，即TGFB[圖8]/TGFBR2[圖9]，表達量與Atezolizumab療效呈負相關。
圖8：TGFB1表達與Atezolizumab療效負相關
[1]
圖9：TGFBR2表達與Atezolizumab療效負相關
[1]
3、效應T細胞相關基因
通過分析CD8A/IFNG/GZMA/CXCL9/CXCL10等效應T細胞相關的RNA表達，構建效應T細胞指數，發現緩解患者相較未緩解患者有更高的效應T細胞指數，且效應T細胞指數與Atezolizumab治療後的OS正相關[圖10]。
圖10：效應T細胞表達指數
與Atezolizumab療效正相關[1]
4
蛋白層面標誌物
1、PD-L1蛋白
通過免疫組化（IHC）的方法對於入組患者腫瘤組織的PD-L1表達進行分析，發現免疫細胞（IC）的PD-L1表達與ORR正相關，而腫瘤細胞 (TC)的PD-L1表達與ORR不相關[圖11]。
圖11：PD-L1表達與Atezolizumab療效的關係
[1]
2、CD8蛋白
通過免疫組化（IHC）的方法對於入組患者腫瘤組織的CD8蛋白表達進行分析，發現其中26%的患者屬於炎性型（Inflamed，此種類型ICB獲益可能性較大），27%的患者屬於沙漠型（Desert，此種類型ICB獲益可能性較小），而剩下約一半（47%）的患者屬於豁免型（Excluded，此種類型ICB獲益中等）[圖12]。
圖12：免疫狀態分型及其在尿路上皮癌中的佔比
[1]
對於不同免疫分型的尿路上皮癌患者，不同標誌物的意義不同，反之，同一個指標在不同免疫分型的意義亦不一樣 [圖13]：
(1)沙漠型：TMB/Teff/TBRS(TGFB相關表達指數)三個指標基本沒有影響；
(2)豁免型：TMB/TBRS兩個指標起著重要作用，兩者聯用預測性能更好；
(3)炎性型：TMB/Teff兩個指標起著重要作用，兩者聯用預測性能更好。
圖13：多指標解釋不同免疫分型的Atezolizumab藥物療效
[1]
5
嘗試克服TGFB引起的耐葯
1、尿路上皮癌模型
對於免疫豁免型尿路上皮癌老鼠模型，分別使用PD-L1單抗、TGFB單抗以及聯合使用兩葯（PD-L1+TGFB），發現抗PD-L1單葯的完全緩解（CR）率為10%，抗TGFB單葯的CR率為0%，而聯合用藥的CR率為70%。這表明抗PD-L1+TGFB聯合應用是克服豁免型老鼠PD-L1單葯耐葯的一個可行方法。
圖14：體外試驗驗證聯合抑制PD-L1/TGFB的重要性
[1]
2、黑色素瘤模型
在黑色素瘤老鼠模型（A375）中，使用PD-L1/TGFBR2雙功能抗體（Y-traps），能夠顯著性減小腫瘤體積而且比單葯明顯[圖15]。
圖15：黑色素瘤體外試驗驗證Y-traps的優越性
[2]
3、三陰性乳腺癌模型
在三陰性乳腺癌老鼠模型（MDA-MB-231）中，使用PD-L1/TGFBR2雙功能抗體（Y-traps），能夠顯著性減小腫瘤體積而且比單葯明顯[圖16]。
圖16：三陰性乳腺癌體外試驗驗證Y-traps的優越性
[2]
展望
看完之後，不知大家和筆者是否有一樣的感覺，未來評價一個患者的免疫檢查點抑製劑的獲益情況必然是基於DNA/RNA/蛋白多維度多指標整合預測模型，而不是僅依賴於單指標；全面的整合分析也必然會發現如TGFB/TGFBR2這樣免疫檢查點抑製劑耐葯相關的位點，這也將為藥物研發提供可靠的位點，推動免疫治療更進一步；這些也是仁東醫學-萬人腫瘤方舟計劃的主要目的之一，很契合，我們正走在正確的道路上。
參考文獻
1. Mariathasan S, Turley SJ, Nickles D, et al: TGFbeta attenuates tumour response to PD-L1 blockade by contributing to exclusion of T cells. Nature 554:544-548, 2018
2. Ravi R, Noonan KA, Pham V, et al: Bifunctional immune checkpoint-targeted antibody-ligand traps that simultaneously disable TGFbeta enhance the efficacy of cancer immunotherapy. Nat Commun 9:741, 2018
3. Rosenberg JE, Hoffman-Censits J, Powles T, et al: Atezolizumab in patients with locally advanced and metastatic urothelial carcinoma who have progressed following treatment with platinum-based chemotherapy: a single-arm, multicentre, phase 2 trial. Lancet 387:1909-20, 2016
4. Balar AV, Galsky MD, Rosenberg JE, et al: Atezolizumab as first-line treatment in cisplatin-ineligible patients with locally advanced and metastatic urothelial carcinoma: a single-arm, multicentre, phase 2 trial. Lancet 389:67-76, 2017
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