兒童自閉症的發生與孕期媽媽的腸道菌群密切相關！
前幾期的「生命樹之謎」中 ，小編們為大家細緻講述了胎盤這棵「生命樹」的「前世今生」，以及胎盤發育障礙或母體機能異常與胎兒遠期健康之間的密切關係。例如，患有糖尿病的孕婦可通過誘導胎兒表觀遺傳學改變促使新生兒罹患先天性心臟病。然而不可不知的是，這只是母體不良因素對胎兒健康損害的冰山一角，孕媽媽的身體狀態對寶寶的影響可遠不止此。
2016和2017年，美國哈佛醫學院Jun Huh教授實驗室連續在Science和Nature雜誌上發表了題為「The maternal interleukin-17a pathway in mice promotes autism-like phenotypes in offspring」和「Maternal gut bacteria promote neurodevelopmental abnormalities in mouse offspring」的兩項重量級研究成果，深入揭示了妊娠期間因病毒感染等因素引發的母體免疫激活（maternal immune activation，MIA）與後代神經系統發育異常之間的分子關聯。極為有趣的是，該研究發現母體腸道菌群在其中發揮至關重要的調控作用！
近些年的人類流行病學研究表明，胎兒接觸母體炎症環境會增加自身罹患自閉症譜系障礙（autism spectrum disorder, ASD）的可能性，並且該現象在其它靈長類和嚙齒類動物中同樣存在，但具體的分子機制並不清楚。在2016年發表於Science的研究中，Jun Huh教授團隊首先利用雙鏈多核苷酸（polyinosine: cytosine, Poly IC ）誘導母體免疫激活（maternal immune activation, MIA）構建的ASD後代小鼠模型揭示了炎症因子IL-17a是母體免疫激活後代腦皮質區受損以及行為異常的關鍵調控分子（圖1）。免疫激活後的母體Th17細胞快速活化，產生大量炎性因子IL-17a。外周血高水平的IL-17a可進一步誘導胎兒腦組織IL-17a受體IL-17Ra表達上調，從而導致胎兒神經系統的損傷以及自閉症相關異常行為的發生。
圖1. 母體免疫激活可通過IL-17a誘發後代自閉症樣表型
那麼，母體免疫激活又是通過何種途徑誘導Th17細胞活化從而促使其產生大量IL-17a，該過程中是否存在其他母體因素共同參與胎兒神經系統的異常發育以及ASD樣表徵的出現呢？
此時，作者將目光轉向了母體的腸道菌群。之所以鎖定腸道菌群，主要出於兩種原因：第一，腸道菌群可以通過調控T細胞的激活與分化等多種途徑參與機體炎症反應的調節，這也是腸道菌群受關注之初被發現的除代謝調節外最重要的生理功能；第二，近期眾多研究證實，機體腸道菌群的變化與神經脊髓炎、阿爾茨海默症、帕金森病以及自閉症等多種神經發育疾病的發生相關聯。
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母體腸道菌群中的分段絲狀菌可調控MIA後代ASD相關表型的發生
為了探究母體腸道菌群在MIA誘發後代自閉症譜系障礙中的作用，研究人員首先用廣譜抗生素——萬古黴素預處理雌性小鼠，隨即使其交配受孕，並於E12.5注射Poly IC誘導母體免疫激活構建後代自閉症譜系障礙模型，整個孕期同時給予孕鼠萬古黴素處理。結果發現，萬古黴素處理可有抑制MIA新生後代出現超聲發聲增強，成年後代重複行為增加、焦慮增加、社交互動不足等異常行為，並且胎兒腦皮質區沒有出現於自閉症譜系障礙患者大腦中相似的斑塊狀病變，母體血漿中IL-17a水平也顯著降低（圖2）。這表明，孕鼠腸道中對萬古黴素敏感的共生菌對誘導MIA後代相關的腦發育障礙和行為異常至關重要，可能通過調節母體外周循環中IL-17a的水平影響MIA後代ASD樣表型的發生。
圖2. 母體腸道菌群促使MIA後代行為異常
對於實驗小鼠而言，分段絲狀細菌（segmented filamentous bacteria，SFB）是對萬古黴素敏感的最主要腸道共生菌，並且SFB對小腸中Th17細胞的分化和激活具有重要調控作用。因而作者推測SFB可能介導了MIA後代相關表型的發生。隨後，作者非常巧妙地選用了Taconic Biosciences培育的富含SFB和Th17細胞的C57BL/6小鼠（Tac）和Jackson Laboratories培育的缺乏SFB和Th17細胞的C57BL/6小鼠（Jax）兩種同品系小鼠，通過構建二者單獨飼養、共同飼養以及SFB菌群移植Jax母鼠等多種模型來驗證這一猜想。結果發現，與注射Poly IC 的Tac母鼠後代不同，注射Poly IC的Jax母鼠外周血中IL-17a水平並未增高，其後代也未出現腦皮質異常和MIA相關的行為表型。然而，一旦將同Jax母鼠與Tac母鼠共飼養，或將SFB單菌群移植小鼠的糞便漿灌胃到Jax母鼠，其後代即出現腦皮質異常與MIA相關的行為表型，同時，母體外周循環中IL-17a的水平也顯著升高（圖3）。這些結果有力證實了孕鼠腸道中的SFB會影響暴露於MIA環境後代的長期行為與神經發育結局。
圖3. 母體腸道菌群中的SFB導致MIA後代行為異常
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Th17細胞特異性腸道菌群、TLR3+CD11c+DC細胞產生的炎性因子以及妊娠狀態是MIA後代神經發育異常的必要致病因素
2016年Science文章中作者的研究發現，E12.5給予孕鼠Poly IC注射後12-24h，其外周血中IL-17a水平便顯著升高。如此快速而強烈增加表明，MIA孕鼠外周血中的IL-17a可能主要源自小腸固有層駐留的Th17細胞而不是重新分化的Th17細胞。為了進一步探討Poly IC是否通過激活腸道駐留Th17細胞刺激IL-17a的產生，作者首先從注射PBS或Poly IC孕鼠的脾臟、淋巴結以及小腸固有層中分離T細胞進行原代培養，發現只有小腸固有層T細胞表達高水平的IL-17a。與此相一致，當對PBS或Poly IC處理的Tac、Jax、co-housed Jax、SFB-gavaged Jax孕鼠迴腸中分離的單核細胞再次進行PBS或Poly IC處理時，僅有Poly IC處理後的Tac、co-housed Jax、SFB-gavaged Jax迴腸單核細胞分泌IL-17a的能力明顯增強（圖4）。由此可知，SFB可特異性誘導小腸駐留Th17細胞活化產生IL-17a。
那麼，MIA孕鼠小腸中Th17細胞的活化又是什麼細胞誘導的呢？由於機體中樹突狀細胞（dendritic cell, DC）是介導T細胞活化的主要細胞群體。所以，作者緊接著又分別分離了PBS或Poly IC處理的Tac或Jax孕鼠中迴腸以及脾臟中的CD4+T細胞（Th17細胞為CD4+輔助型T細胞亞群）和CD11c+DC細胞進行共培養，發現與PBS處理組相比，僅Poly IC處理的Tac孕鼠的CD11c+DC細胞可誘導且僅可誘導富含SFB的Tac孕鼠迴腸CD4+T細胞活化產生大量IL-17a炎性因子，但該過程並不依賴於迴腸CD4+T細胞所在的Tac孕鼠有無被Poly IC免疫激活（圖4）。這些結果表明，MIA母體的CD11c+DC細胞和SFB是誘導的必要因素，MIA並不能直接活化迴腸T細胞產生高水平的IL-17a。
由於Poly IC主要通過激活免疫細胞表面的TLR3受體感染機體組織，為了進一步證明TLR3是否是MIA過程中重要的受體分子，作者分別從Poly IC處理的野生型和TLR3-KO孕鼠迴腸中分離CD4+T細胞和CD11c+DC細胞進行共培養，發現不管CD4+T細胞的基因型如何，TLR3-KO的CD11c+DC均無法誘導其活化產生IL-17a（圖4）。小鼠在體模型的結果也顯示，Poly IC處理的TLR3-KO孕鼠不再出現腦皮質損傷和行為異常等表型。從而證實Poly IC是通過TLR受體作用於母體的CD11c+DC細胞間接實現對T細胞的活化調控。
下一步作者期待解決的問題則是CD11c+ DC細胞如何誘導CD4+T細胞活化。早期的研究證實，IL-1β，IL-6和IL-23等炎性因子是Th7細胞分化的關鍵調控因子，因而作者選擇利用IL-17a-GFP報告基因小鼠模型，體外分離迴腸中GFP+CD4+和GFP-CD4+T細胞以及CD11c+DC細胞共培養，並用IL-1β，IL-6和IL-23封閉性抗體處理，發現CD11c+DC細胞分泌的IL-1β，IL-6和IL-23等炎性因子是Th17細胞活化的關鍵調控分子。
考慮到孕期與非孕狀態下母體腸道菌群的差異，作者進一步對兩種狀態下的MIA小鼠外周血IL-17a的水平進行檢測，發現僅妊娠MIA小鼠中IL-17a的水平顯著升高。與此一致，僅妊娠MIA小鼠迴腸中的CD11c+DC可誘導T細胞產生大量IL-17a（圖4）。這些結果充分證實，Th17細胞特異性腸道菌群、TLR3+CD11c+DC細胞產生的炎性因子以及妊娠狀態共同參與了MIA小鼠腸道Th17細胞的活化及IL-17a的產生，從而誘發後代產生行為與神經發育異常的表型。
圖4. MIA母體外周循環中高水平的IL-17a主要由SFB特異性T細胞產生
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人類腸道菌群可通過IL-17a 誘使MIA孕鼠後代產生ASD表型
最後，為了探究人類腸道道菌群是否也對後代自閉症的發生有同樣的影響，作者從妊娠人群中分離腸道菌群並將其灌胃給缺乏SFB的MIA Jax孕鼠，發現其後代也同樣出現了腦皮質發育受損和行為異常等ASD相關的表型，同時伴隨母體外周血IL-17a水平的升高。而用IL-17a的封閉抗體同時處理Jax孕鼠可有效逆轉該表型（圖4）。這表明人類妊娠期腸道菌群也可通過誘導Th17細胞活化促使MIA後代小鼠後代罹患ASD相關綜合症。然而，非常有趣的是，作者後期的實驗表明人類腸道菌群中並不包含SFB，且構成其菌群的主要菌屬均無法導致Jax小鼠腸道內SFB的增加，說明人類腸道菌群具有獨特的方式參與MIA誘導的後代神經發育異常及ASD相關表型的發生。
圖5.人類腸道菌群可通過IL-17a誘使MIA孕鼠後代產生ASD表型
總結與展望
近年來，腸道菌群被證實在神經系統疾病、自身免疫病以及癌症等多種複雜疾病的發生髮展中發揮重要作用，逐漸成為最熱門的研究領域之一。然而，關於妊娠期母體腸道菌群對胎兒發育和後代遠期健康的研究卻鮮有報道。Jun Huh教授團隊連續的兩篇研究從全新的角度闡釋了母體腸道共生菌群對後代神經系統發育的影響。這兩項研究巧妙利用了多種在體小鼠模型、原代細胞分離及體外共培養模型，在縝密的邏輯引導下，通過多種功能獲得和缺失實驗，一步步證實了妊娠期病毒感染或Poly IC處理等母體免疫激活因素可通過TLR受體作用於腸道CD11+DC細胞，促使其產生多種炎症因子，進而誘導母體腸道菌群特異性腸道駐留Th17細胞活化，產生大量炎症因子IL-17a。而母體血液循環中高水平的IL-17a可進一步提升胎兒腦皮質區IL-17Ra的表達，激活IL-17a信號通路，從而導致胎兒腦皮質受損，神經系統發育異常，最終在童年期罹患自閉症譜系障礙等神經系統疾病。
除了腸道菌群，第二篇研究還有一個突出的亮點是將母體腸道駐留Th17細胞-母體外周循環-胎兒疾病聯繫在一起。這不僅突出了母體局部微免疫環境對全身機能的影響，而且更是跨越了胎盤這道母胎屏障，將看似毫無關係的兩個組織或個體連接成為一個有機整體。這也是相比該團隊前一篇研究重要的突破點和創新點（第一篇研究中作者重點關注的是母胎界面Th17細胞的活化狀態及功能對胎兒神經發育的影響）。該理念可能為更加全面地理解各類人類疾病發生髮展開拓新思路。
然而值得注意的是，雖然將人類妊娠期腸道菌群過繼至MIA母鼠腸道後也引發了相似的ASD表型，但真正發揮作用的菌群與小鼠並不一致。因而其對腸道T細胞的調控機制也可能存在差異，需進一步深入探討。此外，更充分地了解人類母體腸道菌群和駐留免疫細胞隨妊娠期變化的模式及其相互作用關係，將為尋找降低母體炎症性神經發育障礙發生風險的最佳途徑提供可靠線索。
整體而言，這兩項研究不僅揭示了妊娠期母體免疫激活導致後代神經發育異常及的分子機理，提供了早期干預和治療兒童先天性自閉症譜系障礙的潛在靶點和有效策略，而且擴大了人們對妊娠期母體機能狀態尤其是腸道菌群與後代健康關係的認識，豐富了母源性胎兒疾病的內涵，同時為妊娠期更有效地避免胎兒童年或成年期疾病的發生提供了重要理論支撐和思路指引。
參考資料
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3. Kim S, Kim H, Yim YS, Ha S, Atarashi K, Tan TG, Longman RS, Honda K, Littman DR, Choi GBet al:Maternal gut bacteria promote neurodevelopmental abnormalities in mouse offspring.Nature2017,549(7673):528-532.
4. Malkova NV, Yu CZ, Hsiao EY, Moore MJ, Patterson PH:Maternal immune activation yields offspring displaying mouse versions of the three core symptoms of autism.Brain Behav Immun2012,26(4):607-616.
生命樹之謎：
中國科學院動物研究所生殖病理學研究組
BOSS簡介：
http://sourcedb.ioz.cas.cn/zw/zjrc/200907/t20090716_2088415.html
Lab簡介：
http://rpb.ioz.cas.cn/yjz/wangyanling/
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