EBV相關性胃癌發病機制及治療

摘要：EBV相關性胃癌(EBV associated gastric carcinoma，EBVaGC)是一種具有獨特臨床病理學特徵的胃癌亞型。近年來，越來越多的研究關注到EBVaGC的發病機制，也為EBVaGC的診斷、治療和預防提供了一定的理論依據。本文通過總結相關文獻，就EBV感染方式、EBV致癌機制、臨床病理學特徵及針對此型患者的治療策略進行綜述。

胃癌病因及致病機制尚未完全明了，可能與機體免疫缺陷、病毒、遺傳易感性、電離輻射和有害化學物質接觸等因素有關。其中EBV是第一個被證實與癌症相關的病毒，成人感染率達90%左右。1990年Burke應用PCR技術首次證明胃淋巴上皮瘤樣癌（lymphoepithelioma-like carcinoma，LELC）中存在EBV感染。1993年Tokunaga等通過原位雜交技術證實胃癌細胞EBV編碼的小RNA（EBV-encoded small RNAs，EBERS）陽性者，將之定義為EBV相關性胃癌(EBV-associated gastric carcinoma，EBVaGC )，其餘的稱為EBV非相關性胃癌（EBV-negative gastric carcinomas，EBVnGC）。全球範圍內EBVaGC在胃癌患者中的發病率有很大差異，一般為1.3%~20%不等，平均為10%左右。EBV感染與胃癌的關係已成為近年來研究熱點，特別是2014年癌症基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)提出新的胃癌分子分型，其中將EBVaGC列為單獨的一類——EBV感染型。本文通過簡述EBV感染細胞的機制、EBVaGC發病機制從而進一步討論針對此型患者的可能治療策略。

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EBV病毒和感染細胞的機制

1964年Epstein和Barr在非洲兒童淋巴瘤培養建立的淋巴母細胞株中發現的一種親人類B細胞病毒，命名為Epstein-Barr病毒，簡稱EBV，屬於DNA病毒。EBV的原始宿主是人類，可以感染B淋巴細胞、上皮細胞和成纖維細胞。

EBV通過不同的機制感染B細胞和上皮細胞。B細胞感染主要始於EBV表面的包膜蛋白gp350/220與B細胞表面的CD21分子結合，再由EBV糖蛋白gp42與B細胞表面HLA-Ⅱ類分子相互作用，隨後經核融合複合體 (gH/gL/gp42)誘導病毒包膜與B細胞內吞膜融合，使病毒粒子釋放入B細胞。缺乏CD21時，由gp85、gp25、gp42三種糖蛋白組成的gH/gL複合體可作為配體與細胞整合素αvβ5/6/8結合，從而誘發病毒包膜與上皮細胞的融合以幫助EBV感染上皮細胞及其鄰近細胞。缺乏gH/gL複合體的重組病毒則失去這種能力。

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EBV潛伏期重要基因及蛋白與胃癌的關係

EBV主要有2種方式感染細胞，分別是裂解感染和潛伏感染，絕大部分情況下病毒處於潛伏感染狀態，不進行複製，這種狀態下的EBV僅表達6種核抗原（EBNA1、EBNA2、EBNA3a、EBNA3b、EBNA3c、LP）、3種潛伏膜蛋白（LMP1、LMP2A、LMP2B）和2種小RNA（EBER1和EBER2），這有利於病毒逃避機體免疫監視從而實現終生潛伏感染。根據EBV在不同腫瘤細胞中的表達情況，分為潛伏Ⅰ～Ⅲ型。潛伏Ⅰ型表達EBNA和EBERs，多見於B細胞中，如Burkitt淋巴瘤；潛伏Ⅱ型見於B細胞和上皮細胞中，表達EBNA1、LMP1、LMP2A、LMP2B和EBERs，如鼻咽癌和霍奇金淋巴瘤；Ⅲ型見於B細胞，表達 EBNA1、EBNA2、EBNA3A、EBNA3C、LP、LMP2A、LMP2B和EBERs，多見於移植後的淋巴瘤。EBV相關胃癌中可以檢測到EBNA1、EBERs、LMP2A等的表達，而無LMP1的表達，不同於Ⅰ型和Ⅱ型感染，而是介於兩者之間的獨特類型。

1. LMP2A 致癌機制

潛伏性膜蛋白（latent membrane protein，LMP）是EBV增殖過程表達的膜抗原，包括LMP1、LMP2A和LMP2B。LMP2A是LMP2基因編碼的、由497個氨基酸組成的蛋白。LMP2A在近一半的EBVaGC中表達，能夠阻止胃癌細胞系中轉化生長因子-β誘導的細胞凋亡。除此以外，LMP2A可以激活NF-κB進而上調凋亡抑制基因survivin表達，有效阻斷細胞凋亡的發生，也可以同細胞周期調控因子CDK4相結合後發揮其一系列下游抗凋亡的作用。LMP2A另一個可能的功能是激活Notch信號通路導致線粒體分裂—融合周期不平衡，表現為增加裂變期。這種改變和不平衡導致細胞移行增多和上皮向間充質細胞轉化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）標誌物的過表達，促進癌細胞的遷徙。另外，LMP2A相關的PI3K/Akt通路在B細胞、淋巴細胞、胃癌和上皮細胞中發揮增強細胞生長和抗凋亡作用。除了上述調節作用外，LMP2A還具有誘導宿主基因組表觀遺傳變化的獨特功能。LMP2A促進STAT3磷酸化，激活DNA甲基轉移酶（DNMT），上調的DNMT1通過其啟動子區域中CpG島的甲基化導致PTEN表達的表觀遺傳沉默。

2. EBERS和EBNA-1

EBV轉錄2個小RNA，包括EBER1和EBER2。EBERs是潛伏期EBV感染細胞中發現的最豐富的病毒轉錄物，目前研究顯示它們在細胞增殖、抵抗細胞凋亡、產生自分泌生長因子和與宿主蛋白相互作用以增強細胞信號傳導方面發揮作用。但目前只有少數研究闡明EBERs在胃癌發生中的作用。

3. BARF1

BamH1 A片段右向ORF（BamH1 A rightward open-reading frame-1 ,BARF1）基因位於EB病毒基因組的BamH1 A區域， BARF1是EBV裂解的早期基因。BARF1幾乎在所有的EBVaGC中均能被檢測到，其可能通過以下方式參與胃癌發生。BARF1與酪氨酸激酶的集落刺激因子受體（FMS）存在功能同源性。BARF1與FMS爭奪配體——巨噬細胞集落刺激因子 (M-CSF)，並形成一種複合物，從而降低了M-CSF與FMS的相互作用，這表明 BARF1在腫瘤中可能發揮免疫調節功能。Chang等研究發現BARF1可能增殖通過上調NF-κB/cyclin D1和下調細胞周期抑製劑 p21 WAF1 刺激EBV感染的胃癌細胞，從而促進 EBV誘導的癌症進展。

綜上所述，LMP2A、EBERs及BARF1作為EBV潛伏期重要的基因及蛋白通過不同途徑在EBVaGC的進展中起著至關重要的作用。

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表觀遺傳異常與EBV相關胃癌關係

許多研究表明表觀遺傳異常，如啟動子區CpG島甲基化，在EBVaGC的致癌作用中發揮關鍵作用。病毒DNA的甲基化決定了EBV潛伏期類型，而宿主基因DNA的CpG島過度甲基化導致許多與胃癌發生有關的腫瘤抑制基因表達水平下調，如LMP2A誘發信號轉導和轉錄激活因子-3（STAT3）磷酸化，從而激活DNA甲基轉移酶1（DNMT1）轉錄和通過磷酸酶-張力蛋白基因（PTEN）啟動子的CpG島甲基化造成抑癌基因PTEN表達減少。除此之外，CpG島甲基化還可以下調p16、p7、hMLH1、THBS1等多個抑癌基因的表達，當這些抑癌基因發生甲基化後，導致細胞生長失去調控。

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微小RNA（miRNA）調控

miRNA是真核生物中一類長度約22個核苷酸的單鏈非編碼小分子RNA。越來越多的研究表明，某些miRNA的失調會誘導不同器官的致癌作用。與致癌基因和抑癌基因機制類似，與癌發生有關的miRNA被稱為致癌miRs和抑癌miRs，其在細胞發育、增殖、分化和腫瘤發生中發揮重要作用。EBV是首個被報道可以編碼miRNA的病毒。 EBV編碼的miRNA對維持潛伏期、細胞生長和病毒在EBVaGC中的免疫逃避中發揮根本作用。

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EBV相關胃癌的檢測方法和病理學特點

如上文所說EBV轉錄的2個小RNA（EBERs）是潛伏期EBV感染細胞中最豐富的。在腫瘤組織中EBV基因檢測方面，EB病毒編碼RNA的原位雜交技術（EBER-ISH）被認為是目前診斷EBVaGC的金標準。由於EBER在EBV潛伏感染的細胞中表達豐富，聚集於細胞核內，且結構穩定，不易被核酸酶降解，因而敏感性和特異性均較高。病理上，早期EBVaGC常可見「花邊圖型（lace-pattern）」的特徵性改變，低倍鏡下表現為病變部位小腺管或索狀結構成不規則融合排成花邊狀或網狀，並伴有豐富的淋巴細胞浸潤，如果活檢標本中見到花邊圖形，通常需要進一步行EBER原位雜交而明確診斷。病理學上可以根據炎性反應及粘連程度把EBVaGC分為3亞型：胃淋巴上皮瘤樣癌（LELC）、克羅恩樣淋巴細胞反應癌和普通胃癌，有超過80％的 LELC存在EBV感染，而僅有10%~20%的普通胃癌感染EBV。

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EBV相關胃癌潛在治療策略

目前EBVaGC尚無特殊治療方法，大多數患者需行手術切除，術式同一般胃癌，術後化療也尚無特異敏感葯。早期EBVaGC淋巴結轉移率低，EBVaGC傾向於在黏膜下層形成良好分界的結節性病變, 與非EBVaGC相比具有較少的纖維化，故手術範圍可能可以適當縮小，可在內鏡下行電凝切除或剝離切除術。對於晚期EBVaGC患者，除了傳統治療方法，應用新的抗病毒藥、基因、免疫、靶向分子治療等方法也為EBVaGC提供了新的機遇。

1. 上調病毒抗原表達——誘導EBV病毒基因裂解療法

EBV在潛伏感染期間，表達病毒基因十分有限，當轉換為裂解複製階段時，數十種病毒蛋白的表達可引起免疫識別和癌細胞的破壞。故誘導裂解療法是促進被感染腫瘤細胞破壞的理想手段。現在有不同類型的誘導方法：放射治療聯合選擇性藥物可誘導裂解病毒基因表達, 增強外源蛋白的免疫識別力。短鏈脂肪酸如丁酸鹽也是具有合理安全性的誘導劑。最近的研究發現誘導缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）蛋白積累的藥物也是誘導裂解療法的良好候選藥物。

除此以外，此前作為單一藥物使用無效的藥物目前正在被考慮聯合使用。如組蛋白去乙醯化酶抑製劑（histone deacetylase inhibitor，HDACI）和蛋白酶體抑製劑硼替佐米。

組蛋白去乙醯化酶是能催化組蛋白氨基末端特定的賴氨酸殘基上乙醯基移除，使得染色質緻密，基因轉錄受到抑制的一組蛋白酶。目前，組蛋白去乙醯化酶抑製劑是活性病毒複製的最有效的誘導劑，它能增加EBV相關淋巴瘤細胞對抗皰疹病毒藥物的敏感性。目前有11種亞型的組蛋白去乙醯化酶抑製劑被廣泛用於誘導EBV裂解周期。有研究發現I類HDAC，特別是HDAC-1，-2和-3型抑製劑在體外和體內能夠充分誘導鼻咽癌和胃癌中EBV裂解周期。其中，FDA批准的HDACI羅米地辛被認為是最有效的裂解誘導劑，羅米地辛聯用更昔洛韋可增加細胞死亡。

EBV感染的腫瘤細胞中EBV的存活和複製需要無數病毒蛋白的作用來操控宿主的泛素蛋白酶體系統以實現逃避免疫監視、破壞細胞周期調控和抑制細胞凋亡。蛋白酶體抑製劑如硼替佐米可以阻擋這些病毒功能，因此是針對EBV相關癌症治療中的新興藥物。硼替佐米和HDACI聯用是一種新的治療方案，可以協同作用誘導殺死EBV相關腫瘤細胞。

抗病毒藥物丙氧鳥苷是一種可通過DNA聚合酶進入DNA鏈中的嘌呤類似物，可以在溶解誘導治療時增強細胞死亡。病毒早期裂解基因BXLF1編碼的胸苷激酶和BGLF4編碼的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶/磷酸轉移酶可以磷酸化丙氧鳥苷，然後停止DNA合成並觸發細胞凋亡，磷酸化丙氧鳥苷的細胞內轉移可導致相鄰細胞死亡。

2. 增強被感染細胞的免疫應答——免疫療法

EBVaGCs常伴有大量CD8+細胞毒性T細胞（CTL）浸潤，目前基於EBV特異性CD8+ CTL過繼性細胞免疫療法已經被探索，並且已有用於治療與EBV感染相關的移植後淋巴細胞增殖性疾病（post-transplant lymphoproliferative disease，PTLD）的先例。另外有文獻報道使用化療聯合EBV特異性T細胞治療鼻咽癌具有一定效果。但目前未見報道將此種方法用於治療EBVaGC患者。EBVaGC與非EBV相關胃癌相比，表現出淋巴細胞高度浸潤和免疫相關基因高擴增。TCGA 研究計劃發現EBVaGC中PD-L1和PD-L2的擴增較頻繁，這種PD-L1/2的過表達提示PD-L1/2 拮抗劑可能成為此型胃癌患者的治療新選擇。最近一項研究觀察到一例腫瘤MSS同時合併EBV病毒表達陽性的胃癌患者經PD-L1單抗Avelumab治療後獲得了很好的療效。研究者認為EBV表達陽性可能是MSS的胃癌患者中可能對免疫檢查點治療有效的一個亞型，非常值得進一步研究。

3. 逆轉病毒相關細胞的生存——靶向及去甲基化治療

上文已從EBV潛伏期基因及蛋白、表觀遺傳學和miRNA調控等方面簡述EBV致癌機制，針對這些不同的信號通路有不同的靶向藥物可供選擇。

PI3K/Akt信號傳導通路參與很多重要生物學過程的調控，其過度激活可導致腫瘤的發生。在EBV相關性腫瘤中的EBV膜蛋白LMP-1和LMP-2A作用下該通路被過度激活，通過下調腫瘤抑制蛋白p53、刺激蛋白質合成、抑制細胞凋亡等促進腫瘤細胞的無限增殖，最終導致腫瘤的發生，因此抑制該通路的激活有利於腫瘤治療。針對該通路的PI3K抑製劑、mTOR抑製劑等有可能達到靶向治療EBV相關性胃癌的目的。

與基因低表達的EBVaGC或EBV陰性胃癌相比，高表達EBV基因的EBVaGC有更多釋放γ干擾素的免疫細胞浸潤，同時表達免疫細胞抑製劑IDO1，而IDO1抑製劑1MT已經被證實可以抑制 IDO1所誘導的耐葯，因此認為，1MT有可能用於EBV基因高表達的EBVaGC的治療。

另有研究表明, EBV陽性腫瘤具有活化的骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)信號, 提示BMP/SMAD途徑也可作為潛在的治療靶點。近來，在來自Zhang等的一項研究中確定了EphA2是EBV感染上皮細胞的關鍵受體。研究中用幾種抑製劑成功阻斷了上皮細胞的EBV感染，包括針對EphA2、EphrinA1（EphA2配體）和2,5-二甲基吡咯基苯甲酸（EphA2的拮抗劑）的抗體，這些發現為阻斷EBV感染提供了獨特的機遇和新的策略。

相對於EBV陰性胃癌，研究者在EBVaGC中更頻繁地觀察到了多種腫瘤相關基因啟動子的 CpG島甲基化。應用甲基化酶抑製劑５-氮雜胞苷可以逆轉EBV的裂解性感染，並導致受感染細胞的裂解。因此，去甲基化劑可以作為治療EBVaGC的潛在特異性藥物。

4. 其他

EBVaGC發病根本原因是EBV感染，故防治EBV具有重要意義，其中，防治EBV最具前景的途徑之一是EBV疫苗。目前對於EBV疫苗的研究集中在預防性和治療性兩個方面。對於預防性疫苗，大部分研究以病毒包膜糖蛋白gp350為靶點，刺激機體產生抗體以阻止病毒感染。此前有進入臨床試驗的EBV-gp350疫苗，但是該重組疫苗不能有效預防無癥狀的EBV感染。對於治療性的疫苗，主要在於提高細胞疫苗應答，以病毒複製感染過程中表達的病毒核抗原(EBNA1、EBNA3)和潛伏膜蛋白(LMP1和LMP2)為免疫治療靶點，刺激機體產生特異性細胞免疫應答，增強細胞毒性T細胞殺傷腫瘤作用。

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結論

EBVaGC是具有獨特生物學行為的一種特殊類型胃癌，其平均表達率為10%。EBVaGC鏡下特點為病變部位小腺管或索狀結構成不規則融合排成花邊狀或網狀，並伴有豐富的淋巴細胞浸潤，若有以上特徵，需進一步行EBER-ISH明確診斷。EBV長期處於潛伏感染狀態，LMP2A、EBERs及BARF1均屬於EBV潛伏期重要的基因及蛋白，它們可通過多種信號通路實現促進細胞生長、抗凋亡、表達自分泌因子、免疫調節等作用。啟動子區CpG島甲基化和EBV編碼的miRNA同樣在EBVaGC的致癌作用中發揮關鍵作用。誘導裂解療法、免疫療法、靶向治療及去甲基化治療等均可能成為未來EBVaGC患者的特殊治療手段，但目前關於相關研究尚缺乏臨床試驗證據或僅有個例報道，這也意昧著未來面臨著更多的機遇和挑戰。

來源：北京大學腫瘤醫院消化內科

作者：張音潔 王晰程

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