間充質幹細胞在慢加急性肝衰竭中的臨床應用及研究進展

文章來源：中華肝臟病雜誌, 2017,25(9) : 651-654,711

作者：馮蘭艷 張大志

摘要

慢加急性肝衰竭以慢性肝炎急性加重、器官衰竭及病死率高為特點。臨床治療如內科綜合治療、人工肝支持系統、肝移植各自均存在不同程度的缺陷，總體預後不佳。間充質幹細胞（MSCs）作為一種新型細胞治療，來源廣泛，且提取、培養方便，多項研究顯示MSCs治療不僅獲得了較高生存率，並且具有良好的耐受性和安全性，成為臨床應用研究的熱點。現就當前MSCs應用於慢加急性肝衰竭的臨床研究、相關機制及研究進展進行闡述，以期為未來開展臨床試驗及應用提供參考。

慢加急性肝衰竭（acute-on-chronic liver failure，ACLF），指已知或尚未發現的慢性肝病患者，出現黃疸、凝血功能障礙以及發病4周內合併腹水和（或）肝性腦病惡化等急性肝臟損害表現，28 d病死率高[1]。一項多中心研究（CANONIC）納入1 343例發生急性失代償的肝硬化患者，該研究應用連續器官衰竭評估（sequential organ failure assessment，SOFA）、CLIF-C器官衰竭等評分系統進行評分，並將伴隨器官衰竭的患者分為ACLF-1、ACLF-2、ACLF-3，28 d的病死率依次為22%、32%、73%[2]。ACLF的機制尚未明了，國內外大量研究報道了敗血症、酒精毒性、藥物性以及乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染的複發等因素與慢性肝衰竭急性加重的相關性，但40%的患者並沒有發現明顯的觸發因素，在未行抗病毒治療和年輕患者中發病率較高[3]。間充質幹細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一類具有多向分化潛能、自我更新的幹細胞，將其體外培養可誘導分化為骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、骨髓基質、神經細胞等[4,5]。作為新型細胞治療的一種，MSCs廣泛應用於治療多種疾病，包括肝硬化、心肌梗死、退行性神經病變、血友病、腦梗塞及骨缺損等。與肝移植相比，MSCs治療ACLF具有取材方便、低免疫原性等優勢，而且能促進肝細胞再生及修復損傷肝細胞，緩解肝纖維化，分泌大量細胞因子抑制炎症反應，因此可能是慢加急性肝衰竭的一種理想治療。

一、MSCs的來源與提取

1970年Friedenstein等[6]首次從骨髓培養皿中發現一類貼壁的骨髓單個核細胞，在一定條件下可分化為骨細胞、成骨細胞、脂肪細胞和成肌細胞，而且這些細胞擴增20～30代後仍能保持其多向分化潛能，這類細胞被稱為骨髓MSCs（BM-MSC），也是目前在臨床應用最廣及研究最多的MSCs。BM-MSC的來源有同種異體和同種同體兩種，現有臨床研究多認為100 ml是理想的培養及分離所需骨髓量，通過將骨髓離心取得骨髓單個核細胞，採用直接貼壁法收集原代細胞，細胞量為1×106個/ml的接種密度接種於L-DMEM培養基中，經胰酶消化法進行傳代，第5～6代子細胞用於移植治療。

臍帶也是MSCs的重要來源，1991年McElreavey等[7]首次在臍帶中一種稱為華爾通氏膠的黏液結締組織中分離出MSC。因此，臨床上應用的臍帶MSCs實際上是華通膠MSCs（Wharton』s jelly-derived mesenchymal stem cells，WJMSCs，也稱UC-MSC）。提取方法：採集健康胎兒臍帶血50～100 ml，離心而得的懸浮細胞接種於小牛血清以獲得原代細胞，移植治療細胞為第3～4代子細胞。

皮下脂肪組織含有豐富的干祖細胞基質即脂肪間充質幹細胞（AD-MSC），能夠分化為成骨細胞、軟骨細胞等。脂肪組織來源的MSC臨床尚無應用，動物試驗應用於急性心肌缺血損傷、慢加急性肝衰竭等，均取得了不同程度的病理改善。此外，從牙髓、肝、脾等也可分離MSC，研究較少。

二、輸注方法

1．外周靜脈：

經靜脈輸液泵由前臂靜脈緩慢注入MSC為常用輸注方法，多為單次注射。MSCs的數量尚未統一，有研究採用50×106個/ml為一個單位UC-MSC，稀釋於60 ml等滲鹽水中單次注射治療。Zhao等[8]在動物模型中靜脈注射後，發現白細胞介素（interleukin，IL）-10水平及肝小葉中被標記的MSCs細胞數高於肝內或腹膜注射治療。因此，靜脈注射相對其他注入方式具有明顯的優勢。

2．臟器注入：

肝和脾是現有的兩個作為MSCs移植治療的器官。臨床試驗中，肝內注入有經肝動脈和門靜脈兩種方式。對於ACLF患者，臟器內注射存在凝血功能要求、注入路徑選擇及感染評估等考慮，一定程度上局限了臨床研究以及應用，且相比靜脈入徑，存在更高的出血和感染風險。

三、MSCs治療ACLF的臨床療效及安全性

1．提高生存率：

多項臨床研究顯示出了MSCs對提高ACLF患者生存率的優越性[9,10,11,12,13,14]（表1）。Shi等[9]對43例ACLF患者進行80周的隨訪，隨訪至終點時MSCs治療組生存率明顯高於對照組，且在4、12、24周分別提高了41.9%、24.3%、24.3%；Lin等[10]對110例患者隨訪24周，MSCs組4周時生存率為100%，12周時83.9%，24周時73.2%，與對照組相比分別提高了22.2%，19.3%，17.6%。兩項研究均顯示對照組28 d病死率較高（> 22%），而MSCs治療可明顯降低短期病死率（

2．改善肝功能：

Peng等[15]應用MSCs治療了53例終末期肝病患者，治療後4周患者肝功改善顯著，乏力、納差等癥狀緩解，未發現不良反應或嚴重併發症，另有多項臨床研究也證實MSCs移植治療丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）、總膽紅素（TBil）、終末期肝病模型（model of end-stage liver disease，MELD）評分等獲得了不同程度的降低以及白蛋白（Alb）的改善。有研究者分別在ACLF早中晚三期應用MSCs治療發現與對照組比較，早期應用MSCs可明顯改善肝功能，但在晚期慢加急性肝衰竭患者肝功能的改善無差異。另有研究對比MSCs治療組及對照組在4、12、24周時肝功能改善情況，發現治療組膽紅素、MELD評分下降明顯，而兩組Alb的升高或ALT、國際標準化比率（international normalized ratio，INR）的下降在4周、12周、24周時均無明顯差異。

3．安全性：

MSCs免疫原性較低，避免了激發患者免疫反應以及加重全身炎症反應的惡性循環，同時可取材於異體骨髓、脂肪組織等，對於患者而言，取材安全。作為異物，治療方式無論是靜脈還是臟器內注射，MSCs治療均具有感染、出血、過敏等風險，但目前未見相關報道。發熱是目前報道最多的治療後不良反應，且多有自限性或短期藥物治療可好轉。未見研究報道肝性腦病、肝腎綜合征、自發性腹膜炎、靜脈曲張破裂出血等相關併發症。

四、作用機制

目前關於MSCs的作用機制尚未完全明了，動物或體外實驗提出了多種可能機制，如分化、歸巢、免疫調節等等。

1．分化為類肝樣細胞：

MSCs具有多向分化能力由來已久，是一個信號通路及多種生長因子、細胞因子參與的複雜過程。Lee等[16]早期研究發現BM-MSC和UC-MSC可經肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）、bFGF誘導分化為肝樣細胞，採用逆轉錄聚合酶鏈反應檢測到肝相關基因，免疫熒光分析驗證白蛋白的產生，證實MSC可分化為有功能肝細胞。隨後研究發現不僅是骨髓、臍帶，羊膜、牙髓、胎肺等來源的MSC均可誘導分化為類肝樣細胞。Banas等[17]近期的研究也發現AD-MSC不僅可分化類肝樣細胞、表達肝細胞標誌物，同時還發揮著低密度脂蛋白攝取和氨的解毒等肝細胞功能。

Kuo等[18]早期研究顯示MSCs誘導分化為肝樣細胞，其治療效果低於未經誘導的MSCs，動物研究顯示MSCs能顯著改善急性肝衰竭小鼠模型的生存率及肝功能，對兩組小鼠肝臟及血液中幹細胞數量進行對比，治療組肝組織細胞數量無明顯增加，但血液中細胞因子及幹細胞數量增加，提示MSCs分化為肝樣細胞並不能改善肝功能，其分泌功能或許是主要原因。

2．歸巢（遷移）：

目前研究者認為，肝損傷時MSCs歸巢（Homing）至損傷部位分化為類肝樣細胞進而發揮肝細胞功能，但這一機制尚不清楚。Li等[19]在體內和體外實驗表明，BM-MCS歸巢至受損的肝組織受肝和骨髓之間的1-磷酸鞘氨醇（S1P）梯度影響，S1P觸發MSC的遷移，而這一過程受到S1P3型受體（S1P3）調控。Wang等[20]近期發現BM-MSC表達大麻素受體CB1和CB2，當CB1受體激動時MSC遷移能力增強，而CB2激動後則沒有影響。另有體外細胞遷移實驗表明，經轉染而高表達c-Met的BMSCs其遷移能力顯著升高，HGF可能參與其中。而接受c-Met-BMSCs移植的小鼠在提高歸巢到損傷肝臟能力的同時，伴隨著存活率和肝功能升高。

3．旁分泌：

（1）延緩組織纖維化：Suk等[21]研究發現BM-MSC移植治療6個月後，兩組不同劑量治療組患者肝組織中膠原蛋白減少了25%和37%，相比對照組明顯改善了組織纖維化。動物實驗發現將肝星狀細胞（HSC）與脂肪組織來源的MSCs進行體外共培養，HSC數量減少，提示MSCs對HSC可能存在抑制作用，另外提高MSCs的HGF分泌水平，促進肝細胞增殖及修復損傷，這可能與HGF的抗纖維化並誘導HSC凋亡作用有關[22]。HGF具有廣泛的生物活性，目前已知具有促進細胞生長、增殖，抗纖維化等功能，肝組織損傷時HGF的表達上調，發揮著促進組織再生、抗纖維化的作用。幹細胞及MSCs具有分泌HGF[23,24]，促進組織再生、抗纖維化的作用。Shi等[9]應用MSCs的臨床研究發現，相較於對照組，MSCs組患者血清HGF顯著增高。

（2）抑制免疫反應：Xu等[25]發現經MSCs治療後的患者血清中的Treg細胞對比對照組明顯增多，Th17細胞減少。Th17分泌IL 17、IL22等促炎症因子,而Treg細胞可分泌IL-10等，減少自然殺傷T細胞的細胞毒性。Milosavljevic等[26]也在MSCs治療後的小鼠血清中發現Treg/Th17的比值上升，IL-10水平升高而IL-17水平降低。Lee等[27]在MSCs治療動物模型中，檢測到血清中抗炎症因子IL-10水平升高，且觀測到肝細胞凋亡減弱，而MSCs增加血清中IL-10水平，這一過程可能與MSCs促進巨噬細胞由M1型向M2型的轉化過程有關。MSCs不僅分泌多種免疫調節因子，還可抑制轉化生長因子、IL-1、IL-6等促炎症因子的釋放。近期研究提出MSCs分泌外泌體（exosome）、胞外囊泡（extracellular vesicles）等可能參與調節細胞再生及免疫[28,29]。

五、MSCs治療存在的問題

1．適宜的MSCs劑量及注入方式尚未明確：

MSCs移植治療的療效受多種因素影響。一方面，不同來源的MSC造成了細胞質量及數量的差異。UM-MSC相比BM-MSC取材來源更為廣泛，不受供者或患者年齡、健康狀況等影響，是更為理想的來源，但也有研究提出臍帶血中的MSC量較少，取材及培養需要較為全面的技術掌握。而BM-MSC的缺點是骨髓取材量的局限性，使得傳代培養>5代時才有可能獲得足夠的治療量，並且接受同種移植的患者需對取材及治療進行雙重評估其感染及出血風險。另外，雖然酶解法獲得的細胞數量大，培養時間短，但細胞純度略低，細胞可能因消化酶的損害無法貼壁與生長，而MSCs的來源及異體供體的年齡、免疫狀態等對MSCs的分化潛能也有影響。現有的研究同樣未能顯示出給藥劑量對生存率及肝功能的改善是否存在差異，因此何種來源的MSC是理想的移植細胞需要更多的對比研究。另一方面，輸注方式多種，治療頻率不同，風險及療效也就不同。當前的研究多為MSCs單次治療，有動物研究對比單次及重複MSCs移植治療，兩者之間對肝功能的改善沒有差異。靜脈注射相對其他注入方式具有更低的出血、感染、過敏風險，是更為安全、方便的治療途徑，但是缺乏MSCs相關追蹤手段及療效評價指標，而且靜脈內給葯與臟器內給葯療效對比的臨床研究極少。

2．MSCs治療發生腫瘤的風險：

MSCs的多向分化潛能、增強細胞增殖能力、免疫調節等不僅可以改善組織、器官功能，同時也是腫瘤發生的有利條件。MSCs目前的臨床研究中尚未觀察到MSCs增加了腫瘤的發生率，但Eun等[30]報道了MSCs治療後組織基質中可分離出屬於肝癌細胞系的SK細胞，認為MSCs可向腫瘤幹細胞CSC轉化。未來仍需要相關臨床研究幫助了解MSCs移植治療是否增加腫瘤風險。

參考文獻（略）

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