微小RNA在結腸癌中的研究進展

結腸癌是世界上發病率較高的惡性腫瘤，在發展中國家其發病率正逐年上升。雖然有手術和化療等多種治療方法，但是本病的預後仍不樂觀。臨床上很多患者診斷時已是晚期，手術後很快發生複發或轉移。因此，關於鑒定結腸癌生物標誌物的研究具有重要的臨床意義。研究結果表明，微小RNA（MicroRNA）是一種新的生物標誌物，可應用於結腸癌的早期診斷、治療和預後評估。MicroRNA是一類非編碼RNA，含18～25個核苷酸，可影響轉錄後基因表達。其通過綁定靶MicroRNA的互補序列而發揮作用。此互補序列可存在於mRNA的編碼區、5′非翻譯區（UTR）或啟動子區。據估計，約30%蛋白質的產生過程受MicroRNA調控。MicroRNA具有多種生物學功能，在細胞生長和發育的過程中起多種調節作用。MicroRNA還涉及到腫瘤、糖尿病、自閉症、脆性X綜合征、阿爾茨海默病以及心臟病等多種疾病。鑒於其在不同疾病（包括結腸癌）中的重要性，本綜述目的是更準確地識別和了解MicroRNA在結腸癌中的作用。

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MicroRNA結構、靶基因鑒定

MicroRNA基因編碼主要位於基因間區，部分位於基因內區。大多數MicroRNA通過RNA聚合酶Ⅱ轉錄，少數MicroRNA基因被重複序列（如ALU）所包圍，通過RNA聚合酶Ⅲ轉錄。由這些聚合酶產生的轉錄產物稱為pri-MicroRNA，其結構包括帽子結構（7MGpppG）和多聚腺苷酸尾巴（AAAAA）。在細胞核中，pri-MicroRNA在核糖核酸酶（RNase）Ⅲ即Drosha的作用下形成pre-MicroRNA。本過程是Drosha的蛋白輔助因子DGCR8將pri-MicroRNA的頸環結構裂解形成大約70個核苷酸的pre-MicroRNA，然後由依賴RNA的核轉運受體家族成員輸出蛋白-5將pre-MicroRNA運出細胞核進入細胞質。Pre-MicroRNA通過細胞質內的胞內核酸內切酶Dicer進行二次加工產生一個雙鏈RNA，其長度18～25個核苷酸。其中一條鏈被降解，另一條鏈參與構成效應複合物RNA誘導沉默複合物（RISC）。

鹼基互補配對是MicroRNA與其下游靶基因相互作用的基礎。由於MicroRNA 5′端的第6～7對鹼基在與mRNA的鹼基互補結合作用中起著重要作用，因此通過「Targetscan」搜索該「Seed序列」，可以在全基因組中尋找配對鹼基來預測MicroRNA的靶基因。檢測MicroRNA的方法有很多種，包括實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）、North Blot以及列陣分析等。但是哪一種是檢測MicroRNA的金標準仍有待考證。MicroRNA的作用機制是MicroRNA與靶mRNA上的MicroRNA依賴性基因沉默複合物結合，形成非對稱複合物，其能使Argonaute蛋白與部分或完全互補的靶基因mRNA結合而使其保持轉錄後沉默。絕大多數MicroRNA的互補位點都集中存在mRNA的3′UTR，這就造成了人們往往將研究焦點集中在3′UTR而忽視了5′UTR。但有科學家發現在哺乳動物的報告基因體系中開放閱讀框區非完全互補的基因序列位點可以引發乾擾小RNA（siRNA）介導的基因沉默作用，來抑制mRNA，從而影響蛋白質的表達。這說明MicroRNA的靶位點不光只位於mRNA的3′UTR區。

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受MicroRNA影響的分子信號通路在結腸癌中的作用

細胞的自我生長信號的激活、生長抑制信號不敏感，避免程序細胞死亡，無限增殖潛能，維持血管生成、組織浸潤和轉移導致惡性腫瘤的發生。MicroRNA通過其與靶mRNA的相互作用，在發育、凋亡、分化和細胞增殖等方面發揮作用，這說明了MicroRNA在腫瘤中的直接作用。顯性MicroRNA的表達可用於不同類型癌症的分類。由於MicroRNA與靶mRNA之間的不完全耦合，MicroRNA與mRNA相比更適合腫瘤分類。一個樣品中的幾百個基因和途徑可以通過MicroRNA微探針確定。MicroRNA結構及其功能表明，許多MicroRNA在癌症組織中異常表達。此外，不同的腫瘤類型和癌症分期之間的功能差異與MicroRNA表達相關。不同類型癌症中MicroRNA表達的差異可能是由於癌細胞來源及其周圍基質組織的差異所致。MicroRNA表達的改變可減少與細胞增殖或存活相關必需基因的表達，進而導致腫瘤的形成。然而，這並不意味著MicroRNA直接有助於癌症進展或腫瘤發生。雖然尚未完全明了癌症或癌症的病理狀態的結果是MicroRNA表達變化的直接原因，但是腫瘤細胞中的許多變化，可以直接或間接地影響MicroRNA的表達。這些變化包括基因組重排，MicroRNA基因或蛋白質的異常參與它們的建構，MicroRNA和基因突變的表觀遺傳調控的改變。腫瘤相關的基因組區域或基因組脆性區域中MicroRNA的存在是改變腫瘤細胞MicroRNA表達的主要因素。最近的研究結果表明，大量的MicroRNA與結腸癌有關。結腸癌的致癌過程是由於細胞內的一些分子的改變而導致促生存、促增殖和轉移的信號通路激活，如Wnt信號通路和表皮生長因子受體（EGFR）信號通路，在結腸癌的發生和發展過程中這兩條信號通路中MicroRNA起著重要作用。

1.Wnt信號通路：Wnt信號對於調節腸內基底隱窩幹細胞和上皮細胞的更新活性具有重要作用。不協調的Wnt信號激活會促進細胞生存，抑制細胞的死亡和分化，同時也會激活或抑制胃腸道腫瘤及息肉的產生。腺瘤性結腸息肉病腫瘤抑制因子是CTNNB1的抑制調節因子，也是Wnt信號通路的主要因子。MicroRNA在減少腺瘤性結腸息肉病發病率方面起一定的作用。高表達的MicroRNA-135a/b可以起到抑制APC的作用，繼而導致Wnt信號通路的相應變化。由Wnt信號通路激活MicroRNA-135a/b過表達，與散發炎症性腸病、腫瘤分期、不良臨床事件有關。CTNNB1作為Wnt信號通路中的關鍵因素，與LEF/TCF複合體結合，激活包括MYC和CCND1在內的多種靶基因轉錄。MicroRNA-26b和MicroRNA-34a/b/c直接作用於LEF1 30UTR並抑制其表達。然而，MicroRNA-145通過促進CTNNB1的畸形易位（PAK4介導的MicroRNA-145）作用於CTNNG1。

LEF/TCF的轉錄活性主要受MicroRNA-34家族的影響，因為Wnt信號通路中眾多的非翻譯區都包含這個家族的MicroRNA結合位點。由TP53激活的MicroRNA-34，抑制LEF/TCF複合體的活動性並通過TP53和Wnt信號通路相關聯。TP53功能的失效將引起Wnt信號級聯放大並激活Snail-dependent EMT。

2. EGFR信號通路：EGFR信號通路調節多種細胞活動。帶有EGFR突變的腫瘤具有「癌基因成癮性」。激活的KRAS突變，可以調節下游的EGFR。研究結果表明，MicroRNA可以作用於KRAS網路而導致結腸癌細胞增殖。現已證實，MicroRNA-143在結腸癌中被抑制，KRAS的表達與MicroRNA-143的表達相反。在被轉染抗MicroRNA-143的人結腸腺癌細胞中，除了細胞增殖增加，KRAS也伴隨著增高。與之相對的，被轉染了MicroRNA-143的人結腸腺癌細胞中，KRAS和細胞增殖都有所減少。KRAS調節多類同種型Let-7家族。Let-7a位於染色體9q22.3，在體外實驗中，Let-7a可以組織KRAS的翻譯產生抑制細胞生長，據此，Let-7a的下調控制可以通過激活KRAS調節結直腸致癌作用。在其他的研究中，在結腸癌中下調的Let-7a-1，Let-7a-1類似物會引起RAS和CMYC蛋白的表達。在此研究中，通過與MicroRNA資料庫對比，證實MicroRNA-143和MicroRNA-145是結腸腫瘤發生中潛在因素，他們同時也發現，MicroRNA-143和MicroRNA-145在結腸癌中也有所減少，在體外將結腸癌細胞中的MicroRNA-143和MicroRNA-145替代之後，會引起細胞增殖抑制。這可以證明MicroRNA的腫瘤抑制作用。研究結果證明，MicroRNA-143轉入細胞之後，減少了細胞外調節蛋白激酶（ERK）5，天然的ERK 5蛋白細胞是MicroRNA-143的作用對象。通過MicroRNA目標預測技術，MicroRNA-145作用於胰島素受體底物-1（細胞分裂素）。他們通過熒光素酶報告基因雜交技術，證明了MicroRNA-145轉染的下降，MicroRNA-145在體外抑制細胞增殖。部分基因通過作用於PIK/AKT中心下游在EGFR信號通路中起作用。

在9號外顯子、PIK3CA、異常的30 UTR的突變和MicroRNA-520a、MicroRNA-525a負相關，這些突變也和塞卡替尼的敏感性有關。這種變異可以作為預測、提高塞卡替尼療效的指標。顯而易見，二階段接受塞卡替尼治療的結腸癌患者的無進展生存期無提高。MicroRNA-126在結腸癌中經常被錯過，可以在信號通路開始調節磷脂醯肌醇-3激酶（PI3K）的活性。MicroRNA-30a在轉移性結腸癌中也有所降低，已被證實作用於PIK3CD。在10號染色體上檢出的磷酸酶和張力蛋白同源蛋白（PTEN）作為PI3K/AKT的主要抑制因子，在諸多人類惡性腫瘤或突變中都被抑制。在結腸癌中，PTEN被MicroRNA-19、MicroRNA-21、MicroRNA-32和MicroRNA-92-1-5p調控。

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MicroRNA作為結腸腫瘤的檢測及診斷工具

MicroRNA可以提高癌症的診斷和臨床管理水平。一個理想的、完整的探針應無創、方便。因此，分析在癌症患者血中MicroRNA是一種合適的檢測腫瘤的方法。MicroRNA微陣列通過標記的靶序列與MicroRNA的雜交可以識別組織樣本中幾百個基因的表達。MicroRNA的表達與腫瘤的臨床和生物學特徵有關，如組織的類型、分化、侵襲和對治療的反應。通過檢測血清或血漿MicroRNA作為診斷標誌物是可能的。因此，在沒有任何侵入性方法的情況下，除惡性白血病外，在血中可以檢測MicroRNA和腫瘤細胞是可行的。

基於腫瘤細胞與正常細胞在表達譜分子學上的特點與區別，MicroRNA可以作為循環罕見細胞的檢測與診斷依據。現已發現高達35種MicroRNA在結腸癌表達譜中扮演上調或下調作用。其中，MicroRNA-106、MicroRNA-31、MicroRNA-21、MicroRNA-25、MicroRNA-20a、MicroRNA-93、MicroRNA-183和MicroRNA-203參與結腸癌的上調過程；hsa-MicroRNA-1、hsa-MicroRNA-126、hsa-MicroRNA-30a、MicroRNA-143、MicroRNA-145、MicroRNA-191和MicroRNA-192參與下調過程。在腫瘤細胞中，MicroRNA調控的區別在於頻繁地刪除或複製特定染色體區域。正常細胞和腫瘤細胞都會向外周血釋放MicroRNA，這些被免疫複合物包裹的MicroRNA稱為胞外體，由於免疫複合物的包裹，可以使其內的MicroRNA免於核糖核酸酶的降解。之前的研究結果表明，在參與統計的95種MicroRNA中，MicroRNA-17-3p和MicroRNA-92a在血漿中的含量明顯升高，而在腫瘤手術後，血漿中這兩種MicroRNA的含量減少。血漿MicroRNA-92a水平也可作為區分腸道腫瘤和炎症性腸病的依據。通過血漿MicroRNA-92a水平也可以將結腸癌、高分化腺瘤同其他結直腸疾病區分開來。以上研究結果均證明，可以將MicroRNA-92a作為有效診斷早期結腸癌的生物標記物。除了血漿之外，外周血、糞便都可以作為檢測結腸癌MicroRNA的樣本來源。在結腸癌、腺瘤患者的糞便中，與對照者相比，MicroRNA-21和MicroRNA-106a的含量有明顯升高。

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MicroRNA與結腸癌治療

MicroRNA阻止腫瘤進展的機制：（1）抑制致癌MicroRNA。（2）使用可以與mRNA相匹配的人造MicroRNA切割致癌MicroRNA。（3）誘導抑癌MicroRNA。（4）以後天因素抑制啟動子的甲基化從而達到減少致癌MicroRNA的表達。與MicroRNA相匹配的反義核苷酸可以減少MicroRNA的表達。人造MicroRNA拮抗劑就是通過此種方式起到治療作用。以人工合成寡聚核酸抑制MicroRNA的原理尚未明確，但是不可逆地結合MicroRNA的分子結構可能為作用之一。與其他腫瘤治療方案相比，這些分子可以提供穩定的抑癌效果與更低的不良反應。不僅如此，在一種稱為「MicroRNA海綿」的方案中，RNA以轉基因方式產生於細胞內部。這些RNA通過競爭連接的方式結合於目標分子，並抑制這些目標分子。腫瘤抑制MicroRNA主要依靠病毒載體轉運。通過包含自我修復基因組的病毒載體技術，可以加速MicroRNA在血液中的傳送效率。以上這些方案的功效仍在研究中。除了病毒載體這種轉運方式之外，質粒、轉座子、陽離子脂質體也是可選的轉運方式。在這些載體的表面鑲嵌單克隆抗體，可以幫助載體特異地將MicroRNA帶入目標器官。DNA甲基轉移酶抑製劑、組蛋白脫乙醯酶抑製劑，可以通過減少DNA甲基化、增加組蛋白乙醯化，達到增加MicroRNA表達的作用。同時，這些藥物也可以通過逆轉MicroRNA的抑癌作用抑制細胞增殖。因為MicroRNA基因多態性造成的潛在耐藥性，促進了在MicroRNA藥物分子學的研究發展。MicroRNA通過調控基因的表達完成與藥物的相互作用。有些作用基因為藥物轉運體或生物酶，部分MicroRNA在結腸癌中可以無限制表達。發展MicroRNA治療的原因：異常表達的MicroRNA在結直腸腫瘤的發生和發展中發揮了巨大作用，通過阻斷或修補異常MicroRNA並恢復其正常作用，可以成為治療以結腸癌為主的疾病治療方案。雖然通過拮抗劑阻斷MicroRNA在理論上和其他抑制方案相同，但是替換MicroRNA方式恢復MicroRNA功能並不是首選方案。Lu等研究結果表明，在結腸癌組織中，MicroRNA-195呈現下調，同時他們也發現，恢復細胞中的MicroRNA-195可以減少結腸癌細胞的發育能力，並促進其凋亡、抑制腫瘤的發生。MicroRNA-9在遠處轉移結腸癌中過表達，以及MicroRNA-9通過下調a連環蛋白促進了結腸癌的運動能力。MicroRNA的表達受氟尿嘧啶等抗代謝藥物的影響，Let-7g和MicroRNA-181b的表達受藥物的化學反應影響巨大，Let-7的結合位點位於KRAS的3′UTR，此位點和西妥昔單抗的藥物反應關係密切。

自發現MicroRNA與腫瘤的關係密切以來，MicroRNA就被建議應用於腫瘤的診斷與治療。檢測血清及體液中MicroRNA水平為腫瘤診斷及預後提供了良好的前景，通過采血單獨測定MicroRNA或將其與其他標誌物結合起來檢測早期腫瘤將成為可能。關於MicroRNA目標分子的檢測和其在分子信號通路中的作用的研究可以幫助更好地理解腫瘤的發生和發展機制。考慮到目前大部分檢查方法無法在早期檢測到腫瘤的存在，在血液中檢測腫瘤組織釋放的MicroRNA在不遠的將來可能會成為腫瘤早期診斷的關鍵步驟。

在癌症治療過程中，可應用MicroRNA在分子水平發揮作用來影響目標分子。然而，仍然存在一定的困難和問題：同一種MicroRNA可以調控不同基因的表達，所以任何MicroRNA的變化都會導致目標基因的變化；另一方面，一種特定基因可能同時受到幾種MicroRNA同時調控，所以想僅通過控制一種MicroRNA的表達來調控目標基因又是遠遠不夠的；此外，依靠反義寡核苷酸在腫瘤內轉運減少MicroRNA表達，可能不可逆地作用於非目標MicroRNA而影響疾病發展過程。綜上所述，為了優化MicroRNA的使用，提高其生物效率、減少其不良反應，還需要開展更進一步的研究。

轉自：中國醫師進修雜誌 公眾號

作者：張好剛 徐訓政 喬鵬飛 吳德全（哈爾濱醫科大學附屬第二醫院普外科）

來源：中國醫師進修雜誌，2017，40（9）：861-864.]

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