清華大學李強/北京化工大學王文雅在構建宿主非依賴型T7表達系統方面取得新進展

構建獨立於宿主系統之外的標準遺傳元件，即正交元件（orthogonal element/genetic circuit），並將它們應用在不同宿主中，是代謝工程和合成生物學研究的重要工作。

來自於噬菌體的T7轉錄表達系統（包括T7 RNA polymerase（T7 RNAP）和T7 啟動子），是常見的正交元件，已經被應用於原核、真核、無細胞體系中轉錄重組DNA。多種原核生物菌種都已經構建出了T7表達系統，其中以Novagen公司推出的大腸桿菌pET系列質粒的T7蛋白表達系統應用最為廣泛。

考慮到T7表達系統的過度表達會導致宿主細胞負擔過重，目前使用的T7系統普遍需要將T7 RNA聚合酶（RNAP）整合到宿主基因組中以降低其表達量，同時將T7啟動子及其表達的目標基因放在質粒上。但對於遺傳背景遺傳背景不清楚或重組系統不發達的工業微生物，整合T7 RNAP基因到基因組上存在著困難。

有實驗室通過構建雙質粒或多質粒系統（一個低拷貝的質粒放置T7 RNAP，其他高拷貝質粒放置T7啟動子和目標基因），來避免整合T7 RNAP到基因組的步驟。但是，對於大多數工業微生物來說，尋找2個及2個以上兼容質粒並非容易。

如果能夠靶向降低高拷貝質粒上的T7 RNAP蛋白合成量，就能構建T7 RNAP、T7啟動子和目標基因位於同一質粒上的表達系統，進而擴大T7系統的應用範圍。2014年，清華大學李強課題組初步利用反義RNA技術調低T7 RNAP的實驗顯示，HITESV1.0單質粒T7表達系統分別在大腸桿菌和中華根瘤菌中成功表達了綠色熒光蛋白（GFP）和D-海因酶，蛋白表達量在SDS-PGAE電泳圖上清晰可見（Journal of Biotechnology,2014,189:72–75）。

最近，清華大學李強和北京化工大學王文雅該課題組通過進一步優化了反義RNA結構，刪除CAP位點，重新設計了RBS序列等操作，構建出了可精細調節目標蛋白表達量、穩定表達蛋白的HITESV2.10單質粒T7表達系統。採用該系統表達的重組大腸桿菌連續轉接20次以上，目標蛋白表達量無明顯變化。宿主通用性實驗顯示HITESV2.10在革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌中均可使用。該研究目前已在線發表於ACS Synthetic Biology（DOI: 10.1021/acssynbio.8b00055）。該方法在酶工程，代謝工程和合成生物學研究，以及重要工業微生物菌種基因工程改造上將有廣泛的應用潛力。

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