還在用試劑盒提取質粒的你，懂得它背後經歷了什麼嗎？

最新 04-16

說起提取質粒，想必是做分子生物學的搬磚工們每天的常規工作。隨著各大公司開發出各種質粒提取 kit，為苦逼的生物狗帶來了福音—試劑再也不用自己配了，提取步驟再也不用那麼繁瑣了。

但，你先別著急高興，久而久之，很多剛進實驗室的小白師弟師妹再也不懂得背後的原理：質粒提取出來摻雜有蛋白或者基因組 DNA 怎麼辦？待轉染或酶切的質粒被有機溶劑污染了怎麼辦？且聽我一一道來。

質粒是獨立於基因組外的小型環狀 DNA 分子，能夠自我複製，在分子克隆中是最常用的外源基因載體。在自然狀態下，質粒常存在於細菌中，攜帶對宿主在某些特殊情況下的抗性基因，例如抗生素抗性基因。

舉個栗子，如圖所示，這是質粒 pBR322 的示意圖，第一個被廣泛用作基因載體的質粒。不僅能夠獨立自主複製（ori），而且在多克隆位點（Multiple cloning sites）處可以插入想要表達的目的基因，將插入目的基因的質粒轉化到細菌或真核細胞中，在合適的條件下目的基因便可得到表達。

為了方便驗證轉化是否成功，質粒上還帶有篩選標記——抗性基因，在質粒 pBR322 中是 amp 和 tet 抗性。在轉化後，向培養基中加入 amp 或 tet，能夠生長的菌株就是成功轉化的。

說了這麼多，我們怎麼得到這麼好的質粒呢？下面我想大家介紹一種最經典，也是最靈活的質粒提取步驟和每個步驟的原理。

一一

細菌的培養

1. 從瓊脂 LB 平板上挑取單菌落，接種到液體 LB 培養基中，過夜培養。

Tips：菌體里的質粒一般含有抗生素抗性基因，在細菌培養過程中要向培養基中加入相對應的抗生素，以防質粒丟失。

二

細菌的收穫，裂解

細菌的收穫一般通過離心進行，而細菌的裂解有多種方式，包括離子型/非離子型去污劑，有機溶劑，或者鹼裂解，加熱等。選擇哪一種方式主要看質粒的大小，大於 15kb 的大型質粒要注意採用溫和的方法（溶菌酶法），劇烈的方法容易使它收到破壞。

而小於 15kb 小型質粒則可採取相對劇烈的方法（鹼裂解法或煮沸法）。由於我們平時大多質粒都小於 15kb，所以今天主要講最常用的鹼裂解法小提質粒。

1. 將培養過夜的大腸桿菌培養液倒入 1.5 ml 小離心管中，在小離心機中 12 000 rpm，4 ℃ 離心 30 s。

2. 儘可能倒干培養液上清。

3. 將細菌沉澱，所得重懸於 100 μl 用冰預冷的溶液 I 中，劇烈振蕩。

溶液 I

50 mmol/L 葡萄糖

25 mmol/L Tris HCl（pH8.0）

10 mmol/L EDTA（pH8.0）

Tips：這一步主要作用是重懸菌體，EDTA 是金屬螯合劑，主要作用是防止下一步的裂解過程中內切酶對質粒進行切割。

4. 加入 200ul 新配置的溶液 II，蓋緊管口，快速顛倒離心管 5 次，切勿震蕩，將離心管置於冰上。

溶液 Ⅱ

0.2 mol/L NaOH（臨用前用 10 mol/L 貯存液現用現稀釋）

1% SDS

Tips：菌體在強鹼性條件下裂解，釋放出包括質粒在內的核酸，蛋白等物質。注意混勻要輕柔，否則基因組 DNA 裂解成小片段，有可能對質粒造成污染。SDS 作用是結合蛋白質，為下一步做準備。

5. 加 150μl 用冰預冷的溶液Ⅲ，蓋緊管口，將管倒置後溫和地振蕩 10 秒鐘，使溶液Ⅲ在粘稠的細菌裂解物中分散均勻，之後將管置於冰上 3-5 分鐘。

溶液 Ⅲ

5 mol/L 乙酸鉀 60 ml

冰乙酸 11.5 ml

水 28.5 ml

Tips：這一步主要作用是中和，避免質粒長時間在鹼性條件下造成損傷，此時質粒溶解在中和液上清中。SDS 的鉀鹽是不溶於水的，也直接導致與之結合的蛋白質沉澱，由於基因組 DNA 很大，而且與部分蛋白質結合，也造成了共沉澱。

6. 在小離心機中 12 000 rpm，4 ℃，離心 5 min，將上清轉移到新離心管中。

Tips：經過離心，不溶的大分子核酸，蛋白質等物質被沉澱下去，而可溶的質粒在上清中。

7. 加等體積得酚: 氯仿，振蕩混勻，用微量離心機於 4 ℃ 以 12 000 g 離心，上清轉移到另一離心管中。

Tips：雖然經過沉澱可以去除大部分蛋白質，但還是有部分蛋白殘留，所以利用蛋白質在酚中強烈變性，可以比較徹底的將蛋白質抽提掉。酚在水中微溶，所以加入氯仿，以便使酚溶解在有機相中。而且增加有機相的比重，離心後使水相和有機相更徹底的分開。吸取上清時，會看到明顯的兩相分界線，分界線上會看到薄薄的一層白色，這就是變性的蛋白質，注意不要吸到上清中。如果用的是酚的水溶液抽提，那麼還要再加上一步氯仿抽提，以除去殘留的酚，否則會致使酶切，PCR 等反應不能正常進行。

三

質粒的回收

1. 用 2 倍體積的無水乙醇於室溫沉澱質粒。振蕩混合，於室溫放置 2 分鐘。

Tips：乙醇沉澱 DNA 的優點是，它可以與水任意比例混溶，而且不與質粒發生反應，順便還可以溶解去除上一步的有機溶劑，在高濃度鹽的溶液中，加入無水乙醇更容易讓質粒沉澱。

2. 在小離心機中 12 000 rpm，4 ℃，離心 5 min，收集沉澱的質粒。

3. 小心倒去上清液，將離心管倒置在紙巾上，排干殘留的無水乙醇。

4. 加入 1 ml 的 70% 乙醇水溶液，蓋緊蓋管，顛倒數次，在小離心機中 12 000 rpm，4 ℃，2 min，回收質粒。

Tips：在質粒提取過程中，溶液 I，II，Ⅲ中的鹽還殘留在離心管中，這一步主要作用是溶解殘留的鹽，質粒沉澱在下面，達到提純的效果。

5. 倒掉上清，倒置在紙巾上，在空氣中將酒精溶液會發乾凈，直到試管中沒有可見液體。

Tips：注意一定要將酒精溶液揮發乾凈，否則同樣影響進一步的酶切等反應。這裡有個小技巧送給大家，小編平時如果急用的話，會把 EP 管放進超凈台，打開通風，這樣 15 min 左右就完全揮發乾凈啦。

6. 加入 50 ul 的去 RAN 酶和 DNA 酶的 TE 溶液震蕩重新溶解質粒，儲藏於 -20 ℃ 備用。

Tips：如果有滅菌的蒸餾水也是可以的。