非小細胞肺癌——進行分子診斷需注意事項？

NCCN指南——非小細胞肺癌2018.V2

進展或轉移性腫瘤的靶向治療

一線治療

二線治療

EGFR突變

阿法替尼

奧希替尼

埃克替尼

吉非替尼

奧希替尼

ALK重排

艾樂替尼

艾樂替尼

色瑞替尼

布加替尼

克唑替尼

色瑞替尼

ROS1重排

色瑞替尼

克唑替尼

BRAF V600E突變

達拉菲尼/曲美替尼

達拉菲尼/曲美替尼

PD-L1表達

哌姆單抗

阿特珠單抗

納武單抗

哌姆單抗

NCCN指南——非小細胞肺癌 2018.V2

眾多基因的變化影響著治療的選擇。肺癌患者的靶向診斷對於後續進行潛在有效的靶向治療和排除無用的靶向治療，提高臨床受益度是十分重要的。

靶向治療的方法其中包括預測性免疫組化分析，不同於傳統的免疫組化，可用於明確腫瘤類型和遺傳圖譜。

進行分子診斷和解釋分子診斷結果需注意

應在有許可證的實驗室進行分子診斷。

理解使用的分子診斷方法和這些方法的限制

了解在文章中明確提及過的可選擇替代的檢查內容

腫瘤樣本是否適合進行病理檢查和檢查前收集樣本（顯微切割，肉眼切割）

實驗室需要的標本類型樣本的收集和處理

儘管腫瘤檢查主要使用的是FFPE組織，但越來越多的實驗室也接受其他樣本，尤其是細胞病理學體塗片標本。

對於非小細胞肺癌的分子診斷結構可信度的主要限制是當利用儘可能減少入侵性的檢查手段進行收集樣本，則得到的關於樣本的分子、生物靶標、病理結構等信息不足以代表所有腫瘤。

當樣本較小時，實驗室應該使用擴大樣本量技術來進行分子和輔助診斷，包括小穿刺組織的組織學檢查，包括「預先」切片進行診斷。

檢查方法合適的可使用的方法單獨列在下列，部分方法有時需要聯合使用

PCR技術用於用於高度靶向部分的檢測。當應用該技術時僅能監測到該PCR靶向指示的基因變化狀況。

Sanger測序法要求腫瘤組織較高程度的富集。Sanger測序不試用於經過富集後腫瘤組織仍不足 20-30%的樣本，且不適用於需要區分克隆亞型的標本。

若需要應該 Sanger測序法，通常需要進行腫瘤細胞的富集。

NGS在臨床試驗中不斷發展。單獨進行二代測序並不能發現所有的基因組變化類型，但可許多已經發現經個體實驗或聯合實驗證實的基因變化。

還有一些其他可能用到的方法未被例如上述，如SNaPshot，MassARRAY

Fish用於很多實驗進行拷貝數、高表達、結構變異的檢測，如基因重排。

IHC用於特殊的試驗，可作為其他試驗方法的替代。

通常而言，下列描述的突變/變異不包括重疊、即都發現的情況。

儘管有1-3%的非小細胞肺癌可能有多種的變異。

EGFR：是一種表達在細胞膜表面的受體絡氨酸激酶，在許多惡性腫瘤中均過表達

EGFR最常見的突變位點為19號外顯子缺失，21號外顯子的p.L85R的點突變。

這也是EGFR抑製劑TKI的作用靶點。

現有研究表明對於不含有EGFR敏感位點突變的患者不應該採用TKI治療

部分EGRF突變缺少TKI治療靶點，包括由20號外顯子的插入，和PT790M。

大部分的20號外顯子的插入突變預示著 TKI的抵抗

極少部分20號外顯子插入，A763-Y64insFQEA，對TKI治療有效。

因此對於20號外顯子的插入突變需明確位點。

PT790M突變是最常見的TKI治療抵抗的機制。

在進行TKI治療之前，需檢測T790M的水平，因為T790M是家族性肺癌的誘因之一且進行進一步檢查。

隨著 NGS應用的增多，越來越多的 EGFR突變被發現，但與臨床的相關性尚未明確。

部分臨床病理特徵，如抽煙狀況、人種、組織學特徵均與 EGFR突變的發生率相關。但這些相關性特徵不應用於病人 EGFR水平的推測中。

檢查方法：實時定量 PCR、一代測序，二代測序最常用。

ALK重排：是一種發生在 NSCLC上的受體絡氨酸激酶的重排，可導致信號通路的異常。

最常見的重合模式：EML-4儘管有多種的融合模式已經被證實

ALK重排與使用ALK抑製劑有效密切相關，現有研究證實ALK重排可提高艾樂替尼較克唑替尼的在一線治療的療效

ROS1重排：是一種受體絡氨酸激酶，在非小細胞肺癌患者中可重排，後由於ROS1的激酶區域活性異常導致信號通路的異常。

有多種融合模式，最常見的重合模式：CD74、SLC34A2、CCDC6、FIG

有 ROS1重排陽性意味著使用口服的ROS1 TKIs治療有效

部分臨床病理特徵，如抽煙狀況、組織學特徵均與ROS1重排的發生率相關

檢查方法：fish分選法，但需要檢測ROS1的多樣性。IHC法，但其特異度低，且後續需進行證實性試驗確證。

靶向的實時定量PCR部分情況也可使用儘管不能用於監測出新的融合模式，但可用於檢測是否發生融合、二代測序可檢測融合基因。

BRAF點突變：是一種絲/蘇氨酸激酶，MAP/ERK信號通路的中間環節。激活突變的 BRAF基因通過異常調節 MAP/ERK通路引起異常

BRAF的點突變可出現在肺癌患者中，特殊位點 V600E的點突變與口服的 MEK和 BRAF抑製劑聯合治療的藥物抵抗相關

其他位點的 BRAF基因的突變現觀察到肺癌患者中也具有，但其這些形式的點突變與治療的相關性現尚無數據。

檢查方法：實時定量PCR、一代測序，二代測序最常用。

現市場上還提供有BRAF v600e突變的分子克隆抗體，某些研究使用其進行檢測。該抗體應經過大量確認後再推薦臨床使用。

KRAS點突變：是一種G蛋白，本身具有GTPase活性，激活突變的BRAF基因通過異常調節MAP/ERK通路引起異常

有多種突變模式，最常見的模式為：發生在12號外顯子上出現KRAS基因的突變與無突變的患者相比，預後較差。

KRAS基因突變與降低EGFR TKI治療藥物抵抗相關由於缺少廣覆蓋的突變靶點，

KRAS突變的發現常常意味者進一步的分子治療患者獲益較小。

靶向治療進展的檢測

對於大部分上述的檢測靶點，我們對於其藥物抵抗的分子機制越來越清楚。

針對靶向治療後複發，進行樣本的再次檢查可以指導更好再次進行靶向治療。

對於有EGFR敏感突變的進行EGFR TKI治療的患者，至少需要檢測T790M，當無 T790M突變時，需要檢測其他可能的藥物抵抗機制的。

對於有T790M突變的患者，需進行三代的EGFR TKI治療。

檢測T790M突變的方法應該有最少 5%的等位基因的分析敏感性

最初的敏感性突變應該作為內部對照來判定T790M是否在探查範圍內。

對於進行 ALK治療的ALK重排陽性的患者，現尚無數據證實的某一明確的激酶突變位點與進一步的治療相關，儘管已有一些初步實驗結果表明某些特殊的突變區域與進一步治療相關。

IHC 在NSCLC生物標誌物篩選中的應用

PD-L1：PD-L1一個表達在腫瘤細胞表面的共調節分子，從而抑制 T細胞介導的細胞免疫。

T細胞表達 PD-1，是一個抑制性調節因子，可與其配體包括 PD-L1（CD274）或 PD-L2（CD273）結合。兩者結合後，T細胞活性被抑制。

抑制性抗體封鎖 PD-1與 PD-L1直接的相互作用，則可提高T細胞的抗腫瘤活性。

IHC檢測 PD-L1水平可以用於明確一線免疫治療是否有效

IHC有大量抗體可用於檢測 PD-L1表達水平，一些可顯示相對定量，一些不行。

IHC檢測 PD-L1的表達水平需依據其在腫瘤細胞膜上的表達比例，且是一個線性變數。

FDA認可的 PD-L1 IHC檢測是一線治療 50%腫瘤細胞表達，二線哌姆單抗治療 1%腫瘤細胞表達。

陽性和陰性結果的界定標準依據實驗採用的抗體和方式的不同而不同。

腫瘤學家和病理學家的困擾就是 PD-L1的潛在的多種檢測方式的選擇

ALK融合：IHC看作為篩查手段，需要進一步的檢查證實。也可單獨作為替代性檢查決定是否適合 TKI治療，FDA有推薦的 IHC方法。

ROD融合：IHC看作為篩查手段，需要進一步的檢查證實，因為其陽性結果的特異度低。部分患者 ROS IHC+的患者也可不進行進一步確證直接進行 TKI治療，FDA無推薦的 IHC方法。

BRAF V600E突變：現有特異性抗體，某些研究正在檢測其是否可用於 NSCLC。

但當想使用該方法得到較好結果時，發現該抗體有腫瘤特異性且需要進行一定的處理。

EGFR突變：特異性抗體很少。這些抗體特異度高，靈敏度度。

因此除了樣本組織特別少的情況不推薦使用 EGFR-特異性抗體進行檢測，因為許多敏感的 EFGR突變均無法檢測。

新出現的基因變異者的靶向藥物

遺傳改變（驅動事件）

具有抗肺癌中驅動事件活性的靶向藥物高水平

高水平MET擴增或 MET外顯子14點突變

克唑替尼

RET重排

卡博替尼 凡德他尼

HER2突變

Ado-曲妥珠單抗

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