探究通心絡保護心肌細胞的機制

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摘自：

《中國中西醫結合雜誌》2017年37卷第11期

心肌微血管內皮細胞不僅可以控制微循環血流，為心肌細胞供血供氧，而且還是重要的代謝和內分泌器官，心臟微血管內皮細胞通過旁分泌和自分泌功能，在心肌生長發育，組織代謝，收縮功能以及節律控制方面起著重要作用。已有研究表明，心肌微血管內皮細胞結構和功能破壞成為急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）無再流和再灌注損傷、AMI後心律失常及心力衰竭病理過程的重要機制，而且AMI後大部分患者出現心肌電重構、組織重構、神經重構，而導致心律失常的發生，同時AMI患者由於心肌細胞凋亡、炎性損傷、神經內分泌激活進而發生心室重構最終出現心力衰竭。因此深入探討受損心肌微血管內皮細胞對心肌細胞的影響，對闡明上述疾病的病理過程中微血管發病機制，尋找有效干預措施和藥物具有重要意義。

目的

觀察心肌微血管內皮細胞條件培養液對心肌細胞的影響及通心絡的干預作用。

方法

製備3種心肌微血管內皮細胞條件培養液：正常內皮細胞條件培養液(N-CM)，同型半胱氨酸誘導損傷的心肌微血管內皮細胞條件培養液(H-CM)和通心絡干預的心肌微血管內皮細胞條件培養液(T-CM)。將心肌細胞隨機分為4組：正常對照組、N-CM組、T-CM組及H-CM組，採用相應培養液培養。倒置顯微鏡觀察心肌細胞形態，酶聯免疫吸附法檢測細胞上清液心肌肌鈣蛋白T(cTnT)含量，JC-1試劑盒測定細胞中線粒體膜電位(MMP)，Western blot法檢測細胞色素C(CytC)和鈣網蛋白(CRT)蛋白表達。

結果

與正常對照組比較，N-CM組細胞形態無明顯變化，細胞上清液cTnT含量、MMP水平、CRT及CytC蛋白表達無明顯變化(P>0.05)；

與N-CM組比較，H-CM組細胞皺縮，細胞邊緣模糊，有大量壞死細胞漂浮，細胞上清液cTnT含量、CRT及CytC蛋白表達升高，MMP水平降低(P

與N-CM組比較，T-CM組細胞無明顯皺縮，細胞邊緣較清楚，壞死漂浮細胞減少，細胞上清液cTnT含量、CRT及CytC蛋白表達降低，MMP水平升高(P

結論

受損心肌微血管內皮細胞的條件培養液可損傷心肌細胞，其損傷機制可能與CRT介導的線粒體功能受損有關，通心絡可抑制該損傷過程。

心肌微血管位於循環系統的末梢，管壁主要由一層內皮細胞和基膜組成，是心臟微循環的重要組成部分。心肌微血管不僅為心肌細胞運輸血氧和營養物質，還通過旁分泌的作用調節心肌細胞的發育和收縮。這與中醫學脈絡學說關於「孫絡—微血管」末端營衛「由絡以通、交會生化」而發生形氣轉換的氣、血、津液、精等物質代謝與能量轉換的認識是相一致的。「絡以通為用」為脈絡病變的總體治療原則，通心絡為其代表方葯，由人蔘、赤芍、降香、全蠍、水蛭、蟲、蟬蛻、蜈蚣、檀香、酸棗仁、乳香及冰片組成，具化瘀通絡、益氣活血等功效，已廣泛應用於心腦血管疾病的防治，尤其對微血管具有明顯的保護作用。因此本研究選用通心絡為干預藥物，從脈絡學說「孫絡—微血管」保護切入，研究其對心肌細胞的間接保護作用。

cTnT在臨床已廣泛應用，成為診斷心肌損傷的具有一定特異性、敏感性的標誌物。結合細胞形態學變化，本研究中N-CM組細胞形態及細胞上清液中cTnT含量與正常對照組比較無明顯變化，說明正常RCMECs條件培養液可維持H9C2心肌細胞形態及內環境的穩定。而H-CM組細胞核濃縮，細胞邊緣模糊，有大量壞死細胞漂浮，細胞上清液中cTnT含量明顯高於N-CM組，說明細胞受損嚴重。H-CM組所應用的條件培養液，由於Hcy損傷的RCMECs其分泌功能受損，導致一氧化氮分泌量減少，IL-6和細胞間黏附分子-1分泌量增加，氧化應激產物增加，使得條件培養液中營養物質減少，有害物質增加，導致H9C2心肌細胞受損。高效液相色譜和氣相色譜的指紋圖譜技術證實，通心絡的主要成分為芍藥苷、人蔘皂甙Rg1、人蔘皂甙Rb1、酸棗仁皂甙A、酸棗仁皂甙B、異冰片及冰片。有研究表明，芍藥苷可減輕內皮細胞的炎症反應，人蔘皂甙Rg1、人蔘皂甙Rb1對內皮細胞有明顯的保護作用。因此T-CM組應用的條件培養液中通心絡保護了RCMECs，減少有害物質的分泌，故H9C2心肌細胞損傷程度明顯減輕。

線粒體存在於大多數細胞中，是細胞進行有氧呼吸的主要場所，對細胞受到的損傷較為敏感。氧化應激、再灌注損傷和Ca2+超載等多種細胞死亡信號的刺激可使橫跨線粒體內、外膜的線粒體通透性轉換孔保持持續開放，通透性增加，MMP下降，導致跨膜的氫離子濃度梯度消失，引起呼吸鏈脫偶聯，此時線粒體發生滲透性水腫，外膜破裂，使存在於線粒體內的Cyt C釋放入胞質，導致線粒體內的Cyt C減少，直接造成了線粒體內呼吸鏈電子傳遞的中斷，抑制氧化磷酸化，促進了氧自由基的生成，繼而ATP含量減少，可最終導致細胞損傷乃至壞死。研究發現，線粒體功能損傷在心肌細胞中可影響到細胞的損傷、壞死及凋亡的發生。本研究MMP、Cyt C的結果顯示，H-CM組細胞MMP降低，Cyt C蛋白表達增加；T-CM組細胞MMP升高和Cyt C蛋白表達減少，說明通心絡改善內皮細胞分泌功能後可有效減輕線粒體的損傷狀態。

CRT存在於細胞的內質網中，結合鈣的能力極強，是內質網的主要鈣離子結合蛋白，在心血管疾病發生髮展中的作用備受重視。本研究採用Western blot法對CRT蛋白進行檢測，結果顯示H-CM組細胞CRT蛋白表達明顯升高，與H-CM組比較，T-CM組細胞CRT蛋白表達降低。CRT維持了細胞內Ca2+的穩態、調節細胞黏附、蛋白摺疊、凋亡和線粒體膜電位等，其在調節線粒體功能中的作用已被廣泛認同。本研究發現，H-CM組H9C2心肌細胞中CRT蛋白表達上調，同時細胞MMP降低和Cyt C蛋白表達升高，而T-CM組較H-CM組細胞CRT蛋白表達明顯降低，同時MMP升高和Cyt C蛋白表達降低。因此可以推測受損的心肌微血管內皮細胞上清液可通過升高心肌細胞CRT蛋白表達，進而損傷細胞線粒體功能，最終導致心肌細胞受損;TXL可通過改善受損心肌微血管內皮細胞的分泌功能，抑制心肌細胞CRT蛋白表達升高，進而保護細胞線粒體功能，減輕心肌細胞損傷。

綜上所述，受損心肌微血管內皮細胞的條件培養液可損傷心肌細胞，其損傷機制可能與CRT介導的線粒體功能受損有關，TXL可抑制該損傷過程，但在此過程中CRT過表達導致線粒體損傷的機制還需進一步探討。

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