Nature：構建人源化的小鼠模型

小鼠常被用於研究癌症，但科學家仍在努力改善這一模型，以更好地研究人類疾病。

基因編輯的進步使研究人員能夠構建更能反映人類疾病的小鼠模型。

1915 年，全球處於戰爭狀態，日本病理學家 Katsusaburo Yamagiwa 和他的助理 Koichi Ichikawa 正在努力研究一個致命武器，其殺傷力堪比西線戰場的戰爭。這個來自東京大學（Imperial University）的二人組花了 150 多天把煤焦油塗在兔子的耳朵上。最後，他們發現兔子罹患了腫瘤。

Yamagiwa 的兔子模型被認為是第一個用於癌症研究的動物模型。自此，科學家使用了包括細胞系、基因工程小鼠在內的多個模型來模擬人類癌症。但為解答特定實驗問題而選擇模型時需要考慮多個因素。

據馬薩諸塞州波士頓丹娜法伯癌症研究院（Dana-Farber Cancer Institute）的醫學腫瘤學家 David Weinstock 表示，什麼樣的模型是一個好的癌症模型「是一個非常複雜的問題，最簡單的答案是它必須能夠給我啟發——真正回答我想問的問題。如果不能，那就是在浪費我的時間」。

對於美國國家癌症研究所（US National Cancer Institute, NCI）的部門負責人 Nancy Boudreau 來說，模型與人類癌症的相似度至關重要。她表示，模型越能體現人類疾病的發生和發展就越好。理想的癌症模型應該能夠反映人類癌症發生的許多特徵，包括如何應對免疫系統、如何轉移，或從其主要來源擴散到身體的其它部位，以及如何對治療產生響應。這需要科學家了解每種癌症模型的優缺點，因為沒有哪個模型能夠解答所有問題。

一些證據表明，儘管有很多選擇，但現有的癌症模型還不足以開發療法。國際生物技術創新組織（Biotechnology Innovation Organization）審查了從 2006 年至 2015 年的臨床試驗，結果發現，在針對 15 種疾病組別的臨床試驗中，癌症藥物的失敗率最高，在通過臨床 1 期的癌症藥物中，最終獲得批准的比例僅為 5.1%。相比之下，血液學和傳染病藥物的臨床試驗成功率分別為 26.1% 和 19.1%。

德國癌症研究中心（German Cancer Research Center）的血管腫瘤專家 Hellmut Augustin 指出，如果更好的臨床前模型可以將臨床轉化率提高 10%，這將極大地提高臨床前癌症研究的質量，並為藥物開發者節省巨大開支。

研究人員一直為改進現有模型做出了諸多努力。他們在全球範圍內展開合作，希望改善這些模型。例如，NCI、英國癌症研究所（Cancer Research UK）、英國維康信託桑格研究所（Wellcome Trust Sanger Institute）和荷蘭烏得勒支的非營利性組織 Hubrecht Organoid 技術公司聯手開展了一項名為人類癌症模型倡議（Human Cancer Models Initiative）的計劃。該倡議於 2016 年啟動，目標是在細胞系中開發 1000 種新型癌症模型，以供全球研究人員使用。這些項目表明，許多科學家都認同擴大癌症模型庫的價值。

修飾小鼠基因組

一般情況下，細胞株都可以幫助我們解決很多研究難題。但這些細胞通常以 2D 形式生長，缺乏人類癌症生長，尤其是免疫系統生長的正常條件。這使培養的細胞不適合模擬癌症的多個特徵。NCI 的癌症系統生物學家 Shannon Hughes 指出，相比之下，基因工程小鼠（genetically engineered mouse, GEM）適用於多個研究。它們能更好地模擬人類癌症特徵，並且容易操控。

多年來，基因工程小鼠需要複雜的過程來產生所需的 DNA，在培養基中轉化細胞，然後將其注入到小鼠胚胎，以修飾小鼠的基因。但是，與大多數其它遺傳修飾應用一樣，現在製作 GEM 的方法隨著 CRISPR 基因編輯系統的問世而獲得改進。紐約威爾康奈爾醫學院（Weill Cornell Medical College）的癌症生物學家 Lukas Dow 表示，CRISPR 可以完成一些非常精細的、以前無法完成的操作。例如現在誘導大型染色體重組，如反轉、缺失和易位的技術已經比較簡單直接了。但有了 CRISPR 後，科學家甚至可以精確改變嚙齒動物的 DNA 中的一個鹼基。他指出，這種技術還可以清晰到讓每個鹼基的解析度準確再現科學家在人類癌症中觀察到的精確突變。以前的癌症模型都忽略了這些細節，但是病因往往就在這些細節里。

韓國基礎科學研究所（South Korea』s Institute for Basic Science）的基因組工程師 Taeyoung Koo 等人使用 CRISPR 靶向一個非小細胞肺癌（non-small-cell lung cancer, NSCLC）突變。他們報告指出，15% 的人類 NSCLC 病例涉及表皮生長因子受體（epidermal growth-factor receptor, EGFR）基因中僅一個 DNA 鹼基的改變（即單核苷酸突變）。目前治療方案主要是使用靶向該基因的突變蛋白的藥物，例如 gefitinib。

Koo 的團隊開發了 CRISPR-Cas9 嚮導 RNA 序列，該序列識別最常見的 EGFR 突變區域（這種突變占 EGFR 突變相關 NSCLC 病例的 40% 以上）。然後他們將人類 NSCLC 腫瘤植入小鼠，並用 CRISPR-Cas9 和特定的嚮導 RNA 靶向突變。結果顯示，設計合理的嚮導 RNA 能準確地打斷致病序列，產生治療效果。他們報告稱，Cas9 酶可以有效區分 EGFR 突變型等位基因與野生型等位基因，從而破壞致癌基因，誘發癌細胞死亡。

Dow 提醒，雖然 CRISPR 具有顯著的靶特異性，但其切割結果高度多變。因此，如果目標是在所有病例中都產生一致的遺傳變化，那麼 Cas9 之類的核酸酶就不是一個好選擇了。傳統 CRISPR 系統中 DNA 修復的隨機性意味著，你需要面對細胞異質性的問題。

一個乳腺癌細胞在顯微鏡下遷移。

GEM 有其局限性，特別是在疾病的發展時間和異質性方面。據 Hughes 解釋，小鼠腫瘤發展非常快，從而迫使研究人員加快他們的實驗進度，但這與人類疾病的發展速度大不相同。此外，小鼠腫瘤往往過於同質，而無法正確反映人類疾病：GEM 通常只包含一兩個基因改變，而人類腫瘤通常有很多基因改變。

為了解決缺乏異質性的問題，併產生更忠實於人類癌症的模型，德州大學安德森癌症中心（University of Texas MD Anderson Cancer Center）的生物醫學科學家 Lorenzo Federico 等人在系統生物學家 Gordon Mills 的實驗室里展開研究，設計了一系列來自轉基因小鼠原髮乳腺腫瘤的可移植細胞系。最後他們得到了 12 個新的小鼠移植細胞系——可以可靠地產生具有一系列突變的特定類型的腫瘤小鼠模型。Federico 表示，理想的情況是，不同小鼠發生的不同原發性腫瘤應具有不同的分子改變，以更忠實地反映人類癌症的遺傳特徵。

這些模型已被用於靶向治療（包括癌症分子途徑抑製劑）的臨床前評估。根據 Federico 的說法，這些模型也非常適合研究免疫系統在腫瘤發生和治療發展中的作用。然而，他指出，由於這些移植物來源於基因工程小鼠腫瘤，對於得到的結果，「我們需要保持謹慎」。

癌症如何發生和發展，取決於它與宿主免疫系統的相互作用。其中一些最有希望的治療方法是免疫療法，它通過激活患者的免疫系統來攻擊特定的腫瘤。為了研究這些療法，科學家需要具有完整免疫系統的小鼠——最好是具有人類的免疫系統。這就需要人源化的小鼠模型。

為了讓 GEM 擁有人的免疫系統，科學家要將人造血幹細胞（多種血細胞的前體細胞）植入免疫缺陷的小鼠體內。這一過程重現了人體免疫系統的某些方面，例如負責攻擊外來細胞的白血球。然後，研究人員便可以將人類腫瘤樣本（病人源性腫瘤異種移植物，patient-derived xenograft, PDX）移植到小鼠體內，創建更真實的人類疾病模型。

根據 Augustin 的說法，PDX 模型越來越受到藥物開發者的歡迎。藥物開發商將 PDX 用作藥物測試的試驗基地。PDX 模型也開始進入基礎研究實驗室，並且可以在市場上購買到。緬因州巴爾港的傑克遜實驗室（Jackson Laboratory）與超過 20 家癌症診所合作，創建了 450 多種這類小鼠模型，其中包括急性骨髓性白血病和膀胱癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌和胰腺癌。Jackson 實驗室表示，這些小鼠的成本通常是標準免疫缺陷小鼠的三倍。

科學家也可以開發自己的 PDX 小鼠模型。聖裘德兒童研究醫院（St. Jude Children』s Research Hospital）的腫瘤學家 Elizabeth Stewart 等人使用手術切除的、能反映大腦、骨骼和其它癌症的小兒實體瘤樣本，構建了 67 個 PDX 小鼠模型，這覆蓋了十多種腫瘤類型。

Stewart 等人的目標是創建模型來研究針對不同腫瘤類型的藥物的治療效果——這需要模型準確地代表原始疾病。Stewart 的研究小組決定使用全基因組和全外顯子 DNA 測序技術，從核酸水平上比較 PDX 和原始腫瘤。他們發現，總體而言，PDX 的 DNA 序列在很大程度上與原始腫瘤的基因組特徵相匹配，但也出現了新的突變。據研究人員總結，PDX「保留了患者腫瘤的分子和細胞特徵，以及其發育起源的表觀遺傳特徵」。

這並不是說 PDX 是靜態的。哈佛 -MIT 博德研究所（Broad Institute of Harvard and MIT）的所長 Todd Golub 及其研究小組研究了代表 24 種癌症的 543 個 PDX 模型中的拷貝數變異（copy-number variations, CNV）。他們發現， 原始小鼠 1 次傳代後，60% 的 PDX 中插入了長達 500 萬個鹼基的 CNV 基因擴增區域，4 次傳代後這個概率是 88%。結果顯示，最初模仿人類疾病的 PDX 可以演變成不能模仿人類疾病的形式。當這種情況發生時，PDX 便不能再模擬目標癌症了。

Boudreau 認為，將人類 PDX 模型組織移植到人源化小鼠中會得到最有吸引力的一種新癌症模型，但他表示這「尚未完全實現」，因為研究人員尚未掌握技術的細節。據她補充，隨著科學家對免疫治療和腫瘤響應的機制的興趣的增加，人源化小鼠將會變得非常重要。

回歸原始方法

一些科學家使用 Yamagiwa 的老方法，而不是基因技術來製造更實用的癌症模型。這種化學致癌方法以普通的實驗室小鼠為研究對象，結果可以產生更真實的癌症模型。

據加利福尼亞大學舊金山分校（University of California, San Francisco）的腫瘤生物學家 Melissa Reeves 解釋，用一種致癌物質處理小鼠，就像一種環境因素會造成特定類型的損傷，並獲得特定類型的腫瘤，如皮膚腫瘤。這對於模擬由於重複暴露於特定環境的人類腫瘤很有幫助，因為它模擬了由廣泛基因損傷引起的腫瘤的自然演變。

化學致癌物質可能會在數百個位點破壞 DNA，並且隨著時間的推移影響會繼續存在。Reeves 等人採用這種方法，在小鼠皮膚局部塗抹名為 DMBA 和 TPA 的已知致癌物，誘導小鼠發生皮膚癌，進而研究腫瘤如何從原發部位轉移至繼發部位。她的研究結果表明，皮膚癌不會按順序從一個位置遷移到另一個位置——例如，從皮膚到淋巴結再到肺，而是「通過平行傳播，同時進入淋巴結和肺部」。

Reeves 表示，這一成果證實了一個臨床發現：去除乳腺癌周圍的淋巴結並不總是能夠提高生存率，這一觀察結果促使研究人員推測平行傳播的可能性。

儘管與 GEM 和人源化小鼠相比，化學致癌作用可能可以產生更好的、類似於人類癌症異質性的腫瘤，但實際上這些模型也存在明顯的缺點。通過化學手段誘發原發性腫瘤，然後將其移除並研究轉移過程，可能需要 18 個月。Reeves 指出，另外，每個腫瘤都會有所不同。

同樣，每種癌症模型都不盡相同，小鼠模型並不總是最好的選擇（文末更多閱讀：「類器官模型」）。小鼠的飼養費用昂貴，並容易引起倫理問題，這讓細胞系不失為一種值得考慮的研究對象。

目前，研究人員只能選擇一種最能解答他們問題的模型——儘管存在缺陷。同時，科學家將不斷改善現有模型，並開發新模型。正如 Augustin 指出的那樣，「用於開發和使用臨床轉化率更高的小鼠腫瘤模型的投資非常有意義。」否則，我們可能永遠無法提高臨床試驗中癌症藥物的成功率。

更多閱讀：類器官模型

類器官是一種日益流行的模型。

小鼠並不是研究人員模擬癌症的唯一選擇。一種流行的新興替代方法是類器官——模仿一些器官的微觀解剖，例如血管系統的 3D 細胞培養物。

法國奧爾良分子生物物理中心（Centre for Molecular Biophysics）的分子生物學家 Claudine Kieda 表示，腫瘤就像是一個多種組織合作的器官。3D 細胞模型可充分考慮微環境，例如腫瘤周圍和內部的氧氣水平。

Kieda 的實驗室將黑素瘤和內皮細胞結合在由膠原蛋白、生長因子和一個名為 Matrigel 的 3D 支架組成的基質中。這種混合物允許細胞形成類似於腫瘤及其周圍環境，特別是在氧化方面的結構。Kieda 指出，每個細胞都在像孵化器那樣的環境中工作，氧氣的分壓遠遠高於體內。」

此外，類器官對於藥物開發也很有價值。例如，英國劍橋大學（University of Cambridge）的組織修復生物學家 Meritxell Huch 等人創建了用於藥物篩選的肝癌類器官。這種類型的腫瘤只有 20% 的概率能在小鼠身上生長，但 Huch 實現了近 80% 的成功率——並且該過程的效率大約是 PDX 的兩倍。Huch 表示，速度是主要優勢。Huch 的研究小組利用這些類器官，開發了一種信號通路抑製劑，以用於治療原發性肝癌。

與其它癌症模型一樣，一個好的類器官要儘可能地忠實地重現人類疾病。美國國家癌症研究所（US National Cancer Institute）的腫瘤轉移研究員 Nancy Boudreau 表示，類器官比細胞更具生物學特性，而且比小鼠便宜。

原文檢索：Mike May. (2018) Cancer research with a human touch. Nature, 556: 259-261. 張潔 / 編譯

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