PacBio測序揭示水齡與分歧桿菌之間的關係

飲用水（DW）的微生物質量管理主要是為了減少水生病原菌引起的疾病，現在非結核分歧桿菌（NTM）的感染日益流行，越來越多的證據將NTM的感染與DW聯繫起來，在已被分類的>150 NTM物種中，只有少數被認為是與人類感染相關的。

針對細菌16S rRNA某一個或兩個高變區域的測序被廣泛應用於DW的細菌群落的鑒定，然而，這種測序方法由於解析度低，並不足以來區分不同種的NTM。因此，通過改進DW中NTM鑒定方法對於DW暴露的NTM感染風險評估至關重要。

在本研究中，研究者通過PacBio單分子實時測序克服了NTM鑒定中解析度低的問題。PacBio平台的錯誤隨機及環狀一致性序列(CCS)的自我矯正，實現了低錯誤率，並且由於PacBio長讀長(>15,000 bp)，使單核苷酸多態性(SNPs)得以區分，在某些情況下，達到了微生物細菌在種水平的鑒定。

為了研究DW的水齡與NTM之間的關係，本文利用四種不同的DNA提取方法，來評估DW中NTM提取的總DNA含量及其種類，選擇了最適合的一種DNA提取方法（PCA2），之後研究了由同一DW處理裝置的15個家庭（不同水齡）的DW樣品中NTM組成，並對NTM物種的相對丰度進行了研究，從而揭示了水齡與分歧桿菌之間的關係。

文獻題目

A High-Throughput Approach for Identification of Nontuberculous Mycobacteria in Drinking Water Reveals Relationship between Water Age and Mycobacterium avium

期刊：mBio

影響因子：6.956

時間：2018年2月

01

DNA提取方法的評價

兩種商業化的DNA提取試劑盒（FastDNA、Maxwell）與兩種苯酚-氯仿提取DNA方法（PC1、PC2）詳情如下：

四種DNA提取方法（FastDNA、Maxwell、PC1、PC2）

A：用qPCR方法測定NTM、假單胞菌16S rRNA和細菌16S rRNA基因的DNA提取產量

B：NTM、假單胞菌和總細菌的濃度

PC1與PC2方法提取得到的DNA總量約為Maxwell的2倍，為FastDNA的4倍。通過PC1或PC2(圖A)(分別為P 0.10、0.19和0.66)，獲得的總DNA產量與增加的bead-beating時間(從45秒到2分鐘到5分鐘)之間沒有顯著的差異。PC2使用了高於PC1的十二烷基硫酸鈉(SDS)濃度，當使用5 min時，其總DNA產量(P 0.043)和NTM丰度(P 0.045)(圖1B)明顯高於PC2和PC1的其他條件。通過PC1或PC2(圖1A)(分別為P 0.10、0.19和0.66)，獲得的總DNA產量與增加的bead-beating時間(從45秒到2分鐘到5分鐘)之間沒有顯著的差異。同樣，通過PC1或PC2(圖1B)，在總細菌、NTM和假單胞菌丰度上沒有顯著差異(從45 s到2 min到5 min)。

在後續實驗中採用PC2 bead-beating時間5min來提取DNA。

02

NTM的鑒定方法

rpoB基因的942- 957-bp靶點序列分析中建立的系統發育樹

研究者設計的新開發的rpoB引物擴增長度為942 - 957 bp，並在GenBank資料庫中找到具有全長rpoB序列的41個NTM，包括在難以區分的M. avium (M. avium, M. avium subsp. paratuberculosis, and Mycobacterium intracellulare) 內的物種和亞種。在rpoB上，有3到125個不同區域的NTM，代表SNPs和插入位點。

用於PacBio測序的兩步PCR加barcode的方法

該項研究採用的兩步PCR方法，其中rpob目標引物包含M13 motif，在第一步擴增中放大模板。這一步擴增產生的DNA作為連續擴增的模板，進行第二部擴增加barcode序列，來評估rpoB引物和條碼策略是否可以用於DW, rpoB的NTM區分。

NTM物種和菌株的相對丰度

15個樣品是由1升DW組成，在管道中至少有6小時的停滯狀態。經過序列過濾後，保留了49,728個序列，其中99%為分類學上的分歧桿菌，其序列特徵為85%。NTM物種和菌株的序列特徵為99.8%。陽性對照的rpoB擴增，是兩種NTM操作分類學單位(OTUs)的混合物，被準確地鑒定為M. avium subsp和M. chelonae。陽性對照所獲得的分類學和丰度匹配表明，該測序方法對DW樣品中NTM的鑒定具有較高的可信度。

結論

01

微生物具有生理差異與不同的萃取效率，不同的方法提取複雜環境和生物樣本中的DNA會對微生物的丰度及種類產生影響。而DW中某些NTM物種會帶來健康的風險，我們非常需要通過高通量的方法來檢測出這些NTM。

02

以往對DW中NTM丰度的評估往往依賴於商業化的DNA提取試劑盒，這些試劑盒通常只對細菌細胞進行一定程度的物理破壞，這些商業試劑盒並不包含一些難以溶解的微生物高效核酸提取所必須的試劑。此項研究發現，兩種常用的商業試劑盒與PC2提取方法相比，均表現較差，DNA總量低且NTM含量也低。

03

rpoB引物的開發結合三代PacBio測序分析，使得不需要進行培養的情況下能測定DW樣品中NTM的多樣性。兩步擴增加barcode序列的方法降低了模板DNA量的要求，這對於低濃度的樣品有較大的用處，比如DW樣品。

04

為了區分NTM物種，需要對相對較大(>750-bp)的基因片段(如rpoB和hsp65)進行序列分析，迄今為止的研究都依賴於Sanger測序克隆庫，這種方法需要大量的人力，不適合在DW等環境樣本中檢測NTM。NTM基因組的高G-C含量增加了幾個測序平台的位置誤差的可能性。之前的研究中採用454和MiSeq平台對hsp65進行測序，未能區分M. avium和M. abscessus，在菌株水平上對NTM的區分是有限的。在本研究中，單分子實時測序PacBio平台克服了這些障礙。

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