蝙蝠來源的HKU2相關冠狀病毒引起致死性豬急性腹瀉綜合症

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2018年4月發表在Nature上的一篇文章「Fatal swine acute diarrhoea syndrome caused by an HKU2-related coronavirus of bat origin」，利用病毒學、流行病學和動物實驗等研究手段，證明一種與HKU2有關的新型蝙蝠冠狀病毒，豬急性腹瀉綜合症冠狀病毒(swine acute diarrhea syndrome coronavirus, SADS-CoV)是引起中國廣東省4個養豬場24 693頭仔豬死亡的病原體。武漢病毒研究所周鵬研究員、軍事科學院軍事醫學研究院范航助理研究員、華南農業大學藍天副教授為文章並列為本文第一作者。武漢病毒研究所石正麗研究員、軍事科學院軍事醫學研究院童貽剛教授、華南農業大學馬靜雲教授、新加坡DUKE-NUS新發傳染病研究所王林發院士和美國生態聯盟(Ecoheath Alliance)Peter Daszak為共同通信作者。

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以野生動物為儲存源的病毒對人類和動物的健康產生很大的威脅。蝙蝠是跨物種傳播的新發病毒最重要的儲存源之一，對公共安全影響非常大的新發動物傳染病SARS也來源於蝙蝠。

2016年10月至2017年5月廣東省暴發仔豬致死性疾病，最終導致4個豬場24693頭仔豬死亡。2016年10月28日豬場開始出現死亡病例，在病死仔豬腸道中檢測到豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）。2017年1月12日後，雖然豬死亡病例仍不斷增加，但其腸道中卻再未檢測出PEDV。

圖1 中國廣東省豬感染SADS-CoV的情況監測

表1 2017年1~4月廣東省4個豬場可疑病毒檢測結果

發病仔豬臨床癥狀與其他已知腸道冠狀病毒引起的疫情相似，表現為嚴重急性腹瀉和急性嘔吐，5日齡以內仔豬快速消瘦。感染仔豬發病後2~6 d內死亡，而感染母豬表現為輕微腹瀉，大部分母豬2 d內即可恢復。該病沒有發熱現象。對於5日齡內仔豬致死率高達98%，但對於8日齡的仔豬致死率只有5%。

研究人員對病豬樣本進行了豬流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎病毒等其他已知豬腹瀉相關病毒的檢測。然而，在疾病暴發高峰期，所有病毒檢測結果均為陰性，表明該疾病是一種新發疾病，命名為SAD-CoA，該病毒為SADS-CoV。

通過高通量測序，發現SAD-CoA病毒與香港大學首次發現的HKU2冠狀病毒序列相似度高達95%，而S基因的同源性只有86%。因此，HKU2雖不是SADS冠狀病毒的直接祖先，但兩者在遺傳進化上關係相近，推測他們可能來源於同一個宿主——蝙蝠。

為了證實SADS-CoV來源於蝙蝠這個猜想，研究者針對SADS-CoV的RNA依賴RNA聚合酶（RdRps）進行特異性qPCR檢測，2013~2016年共檢測了來自廣東省7個不同地區的591份蝙蝠肛拭子。其中，58份樣品（9.8%）檢測出陽性，且全部來自於菊頭蝠（Rhinolophus），這種蝙蝠也是SARS病毒的儲存宿主。

表2 2013~2016年間591個蝙蝠肛拭子RdRp特異性qPCR檢測結果

在蝙蝠樣品RdRps-qPCR得到的序列中，用二代測序技術（NGS）挑選出和SAD-CoA一致性最高的4個完整的基因序列，暫稱為SADSr-CoV病毒。分析結果可見，4個SADSr-CoV序列與SADS-CoV的同源性在96%~98%之間，最重要的是，其中2個樣品的S蛋白序列與SADS-CoV的S蛋白序列一致率高達98%。

此外，對19隻蝙蝠SADSr-CoVs確定了S蛋白N末端（S1）結構域的編碼區，以便進行更詳細的系統進化分析。S1和全長基因組的系統進化分析揭示了蝙蝠之間α冠狀病毒的高度遺傳多樣性以及與其宿主之間強大的協同進化關係（圖2b），並且顯示SADS-CoV與來自中菊頭蝠（Rhinolophus affinis）的SADSr冠狀病毒更密切相關，而不是來自於中華菊頭蝠（Rhinolophus sinicus）冠狀病毒，如HKU2-CoV。

圖2 SAD-CoA和SADSr-CoV的基因和系統進化分析

為了分離該病毒，研究者嘗試了多種細胞系。在Vero細胞中傳代5代後，可觀察到細胞明顯病變效果，用免疫熒光和全基因測序驗證分離到的病毒即為SADS-CoV。

為了驗證分離病毒是否符合Koch』s法則，研究者進行了兩組不同的動物實驗。第一組攻擊試驗是用SADS-CoV陽性腸組織勻漿感染SPF仔豬。感染2 d後，攻毒組7隻中有3隻死亡。第二組攻擊實驗挑選來自於廣東豬場的健康仔豬，用分離株接種感染仔豬，對照組接種組織培養基。感染後2~4 d後，接種分離株的50%（3/6）死亡，對照組全部存活。感染組的所有仔豬均出現水樣腹瀉，體重迅速減輕和腸道病變。組織病理學檢查顯示，接種4 d後，SADS-CoV感染組仔豬腸道絨毛萎縮顯著（圖3a、b），仔豬小腸上皮細胞中觀察到病毒N蛋白呈現特異性染色。

表3動物實驗結果

圖3感染SADS-CoV豬組織病理免疫學檢測

值得注意的是，從爆發地區的地理分布、病原生態學背景的角度分析，SADS-CoV和SARS有著驚人相似的流行病學起源。由此，研究者強調監測野生動物體內新型病毒對於防控新發傳染疾病具有重要意義，蝙蝠作為威脅獸醫和人類健康的重要病毒儲存庫，應該受到更大的重視。而通過二代測序（NGS）和系統進化的大數據分析等現代生物學技術手段，聯合傳統病原分離與鑒定技術，可以加速新型病毒的快速確診。

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