陳良怡、譚山合作團隊發明超靈敏海森結構光超高解析度顯微鏡——徐平勇點評

責編 | 迦漵、狄德羅

北京大學陳良怡團隊聯合華中科技大學譚山團隊發明了一種超靈敏結構光超高解析度顯微鏡——海森結構光顯微鏡 （Hessian SIM)，實現了活細胞超快長時程超高解析度成像，能辨清囊泡融合孔道和線粒體內嵴動態。此項成果近日以長文形式在線發表於Nature Biotechnology，論文題目為Fast, long-term, super-resolution imaging with Hessian structured illumination microscopy 。BioArt邀請到了從事超高解析度熒光顯微成像新技術新方法研究的徐平勇研究員做精彩點評，以饗讀者！

眼

見為實。顯微鏡是生物醫學研究領域最常用的工具，但因為其解析度受到衍射極限的限制，很多信息都隱藏在看不清楚的信號中。從英國人羅伯特胡克發明顯微鏡的那一天開始，看到更清楚的細胞器和蛋白等結構，並在活細胞中長時間追蹤它們的動態變化，一直是所有生物醫學研究者的夢想。

21世紀的第一個十年見證了兩百年的夢想逐漸照進現實。隨著不同原理的超級顯微鏡的發明，打破衍射極限、實現超高解析度熒光成像成為可能。相關工作獲得了2014年的諾貝爾化學獎，國際上各大顯微鏡公司也推出了各種各樣的超高解析度顯微鏡。但是，目前的超級顯微鏡都需要超強的激發光，相當於細胞被一萬個太陽到一千萬個太陽所照亮（104~107W/cm2），才能夠得到超高解析度的熒光圖像。同時，強光產生的光漂白效應和對細胞的光毒性效應又極大限制了此類顯微鏡的應用。因此，生物學家仍然渴望降低超高解析度顯微鏡所需要的光照度，真正實現長時間的觀察活細胞內高速變化的動態過程。

針對這個挑戰，陳良怡與譚山兩個課題組聯手改造和重建了現有的結構光超高解析度顯微鏡（SIM）。硬體上，通過盡量提高顯微鏡收集光子的能力（如用高數值孔徑物鏡）和減少採樣每張圖像的時間（如自主設計偏振旋轉玻片陣列以及高精度的時序控制程序），實現每秒得到188幅超高解析度圖像。演算法上，團隊也研發了全新的反卷積演算法，借鑒人眼區分信號和雜訊的機制，首次提出將生物樣本在多維時空上連續、而雜訊是完全隨機分布的先驗知識用於構建海森矩陣，指導超高解析度熒光圖像的重建，從而得到超靈敏海森結構光顯微鏡（Hessian SIM）。依靠這些硬體和演算法的革新，Hessian SIM顯微鏡實現了在傳統SIM顯微鏡光照度1/10的情況下，得到了和十倍照明的傳統SIM顯微鏡同樣解析度和保真度的超高解析度圖像。

海森結構光顯微鏡顯微鏡下觀察到COS-7細胞中的內質網和線粒體相互作用的動態過程，藍色的線粒體用MitoTracker Green標記，可以清楚辨識內嵴結構；品紅色的是用SEC61-mCherry標記內質網結構。

在每秒鐘得到188張超高解析度圖像時，Hessian SIM的空間解析度可以達到85納米，能夠分辨單根頭髮的1/600到1/800大小結構，而所需要的光照度只有8W/cm2（相當於80個太陽左右），小於常用的、非超解析度的點掃描共聚焦顯微鏡光照度三個數量級。由於極低的光漂白以及光毒性，我們實現100 Hz超高解析度成像下連續採樣10分鐘得到18萬張超高解析度圖像，或者是在1 Hz超高解析度成像下連續1小時超高解析度成像基本無光漂白。

與同樣可以用於活細胞成像的受激輻射損耗超高解析度顯微鏡（STED）相比，Hessian SIM可以提供更高的時間解析度。例如，在觀察細胞內囊泡與細胞質膜融合釋放神經遞質和激素過程中，我們的Hessian SIM與STED（巫凌剛實驗室今年3月發表於Cell的研究使用的即為STED）都可以觀察到囊泡融合形成的孔道；但是，只有用Hessian SIM，才能觀察到囊泡融合時四個不同中間態，包括囊泡打開3納米小孔、囊泡塌陷、融合孔維持和最後的囊泡塌陷過程，真正可視化膜孔道形成的全過程（圖2）。

圖2. 囊泡融合孔道形成全過程。A: 實際動態過程；B：30年前的電鏡觀察到的結果；C：隨時間變化的熒光動態變化；D：囊泡融合的四個中間態（融合小孔打開→囊泡塌陷→融合孔道維持→囊泡完全融合）。

Hessian SIM 的低光毒性也幫助它觀察在生理條件下才能工作的細胞結構。例如，線粒體作為細胞內的「能量製造工廠」，其內嵴結構可以在電鏡下觀察到，但從未被之前的超高解析度顯微鏡所清楚觀察到，主要是因為超高解析度顯微成像觀察線粒體的過程產生的光毒性就已經破壞了線粒體的內嵴結構。應用超靈敏Hessian SIM，我們首次在活細胞中連續觀察800張並清楚辨識線粒體內嵴結構和動態，從而首次解析兩個線粒體融合時，或者是單個線粒體分裂時內嵴的活動，以及觀察到單個靜息線粒體兩條內嵴融合成為一條的重組裝過程（圖3）。

圖3. Hessian SIM顯微鏡下觀察到線粒體內嵴結構動態。A. 連續觀察800張COS-7活細胞內MitoTracker標記的線粒體內嵴。B, C. 兩個線粒體融合時：B或是一個線粒體分裂成兩個時; C.內嵴的變化。D. 靜息線粒體內也可以觀察到內嵴的重組。

綜上所述，超靈敏Hessian SIM顯微鏡適用於各種不同細胞、不同探針的熒光成像，適用於所有應用點掃描共聚焦顯微鏡的場景。進一步，它在實現超高解析度顯微成像的同時，首次實現了長時間活細胞超高速成像，是目前成像時間最長、時間解析度最高的超高解析度顯微鏡。可以說，所有應用點掃描共聚焦顯微鏡的場景都可以使用海森結構光顯微鏡，因而具有廣泛的應用前景。

該論文的第一作者為北京大學黃小帥、華中科技大學范駿超和北京大學李柳菊，通訊作者為北京大學陳良怡、華中科技大學譚山。陳良怡、黃小帥等主創成員參與了早先發表於Nature Methods的高解析度微型化雙光子顯微鏡的研製，榮獲2017年中國十大科學進展等榮譽。未來，他們將進一步實現微型化海森結構光的顯微在體成像。

專家點評

徐平勇（中科院生物物理所研究員）

細胞內亞細胞器是動態組裝和快速運動的，不同的亞細胞器有不同的運動速度。有些與亞細胞器相關的生理過程非常快，只有幾十毫秒，例如囊泡的分泌、線粒體的動態組裝、鈣庫的釋放等過程。現有的超高分辨顯微成像方法能夠解析固定的細胞中蛋白質在亞細胞器中納米尺度的相對精確定位，但是對於活細胞中快速運動的亞細胞器的超高分辨成像具有很大的挑戰。主要原因是現有成像技術的時間解析度低，不足以解析快速運動的亞細胞器或者蛋白質的定位。提高現有超高分辨顯微成像的時間解析度至少能產生兩個方面的效果：一是能減少由於快速運動產生的假象，例如快速運動的點成像速度慢時可以變為一條線。二是能提高圖像重構的準確度，例如2D-SIM成像需要9幀原始寬敞圖像來重構一張超高分辨成像圖，重構時假定在採樣9幀原始圖像時亞細胞器結構是不變的。如果採樣時時間解析度低，亞細胞器在這9幀中的結構就是變化的，最終重構出來的結果就不準。這兩種效果最終表現為提高了成像的空間解析度。提高時間解析度後能觀察到活細胞中不一樣的動態結構，例如當STED照射很小的區域提高時間解析度到每秒5幅後就可以觀察到囊泡融合形成的孔道（巫凌鋼實驗室2018Cell文章）。

2D-SIM由於重構時需要的原始圖像的幀數少，比基於單分子定位的PALM/STORM成像技術以及基於點掃描的STED成像技術具有更高的時間解析度，適合大面積活細胞超高分辨顯微成像。然而受限於液晶相位可變延遲器（LCVR）的調製速度，目前TIRFM-SIM成像的最高時間解析度約為0.25秒，不足以觀察線粒體嵴等快速運動的結構。北京大學陳良怡和華中科技大學譚山等合作，發展了基於偏振旋轉玻片陣列的Hessian結構光照明系統，極大地提高了成像的時間解析度（每秒188張超高分辨圖像）。時間解析度的提高意味著每幀圖像的曝光時間縮短，短曝光時間會使得採集到的熒光信號大大降低，弱信號和相對較低的信噪比在SIM重構時會產生很多小圓圈的假象結構。

該工作的另一的創新是發展了在極低曝光時間下弱信號的去噪演算法，用於重構超高分辨圖像，極大地減少了重構的假象結構。Hessian SIM成像技術通過結合硬體上的加速採樣和弱信號的降噪演算法，首次在活細胞中觀察到了線粒體嵴長時程動態運動，對於線粒體功能研究提供了重要的工具。該工作告訴我們，進一步提高超高分辨成像的時間解析度可以觀察到以期觀察不到的亞結構和動態過程。該方法具有廣泛的應用前景，首先，弱信號的去噪演算法可以用到其它的成像方法中用於提高弱信號的信噪比，有望提高其它成像方法的準確度和解析度。另外，由於SIM比PALM/STORM和STED更容易實現雙色超高分辨成像，該方法有望在活細胞中對同一亞細胞器中的不同蛋白進行同時標記和成像，動態監測亞細胞器的組裝和解組裝過程。Hessian SIM成像方法特別適合在COS7等超薄細胞中觀察內質網和線粒體等亞細胞器。

目前該方法的Z軸解析度不高，實際成像應用中受到樣品厚度的影響。希望陳良怡老師在今後的Hessian SIM基礎上進一步發展提高Z軸解析度的成像方法，拓展更多的生物學應用。

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