蛋白質質譜分析9問9答
分子量測定:
Q:為什麼測定的結果跟理論的結果不一致?
A:因為機器測定會有一定的誤差,如100000Da的蛋白質最大誤差是100Da,如果測定的結果與理論值成倍數關係的可能原因是:0.3倍可能是三電荷峰,0.5倍可能是雙電荷峰,原因是樣品含鹼氨基酸較多;2倍可能是二聚體,3倍可能是三聚體,原因可能是樣品中含有過多的二硫鍵。
Q:為什麼我的樣品非常純,但在主峰的附近會有一些小峰?同時在主峰一半或兩倍的地方有一個小峰?
A:這是因為在激光的掃描的過程中可能會使樣品分子損失一些離子,如H2O、NH3等,或者出現樣品分子與基質的加合峰,正常的情況下MALDI-TOF單電荷峰佔主要,所以有時會在主峰一半或兩倍的地方有一個小峰,是雙電荷峰和二聚體峰;
Q:為什麼我的樣品純度、濃度都很好,鹽濃度也很低,卻得不到結果?
A:這隻能與蛋白質本身的結構有關,基質不能很好的分離樣品,所以希望您能儘可能滇供樣品其他的理化質,如酸、鹼蛋白、糖蛋白等。的確,有時您的樣品的所有質、狀態都正常,還是不能得到您想要的結果,這種問題其實已經超出了我們能力的範圍,我們僅僅是您整個實驗的一個環節,能夠做到的是向您提供一個準確的結果。
肽指紋圖譜及資料庫檢索
Q:為什麼考馬斯染色的結果比銀染的結果好。
A:主要是銀染的靈敏度較高,得到的蛋白質量較少,再加上在處理樣品的過程中銀染要脫銀,增加洗脫的次數,樣品的損失較大,所以噪音和角蛋白污染對目的蛋白的影響較大,對最終的資料庫檢索也會產生影響
Q:我的PMF的峰值較少,為什麼?這些片段數量及峰值是否達到最基本的資料庫檢索的要求?影響檢索的結果嗎?
A:因為我們用的是胰酶對蛋白質進行降解的,胰酶是一種專一較強的酶,只水解精氨酸、賴氨酸的C端,可能是你的樣品的酶解的位點偏多或偏少,偏多酶解為小片段,峰值跟基質在一起難以分辨,偏少肽段的分子量偏大,膠內的樣品滯留在膠內,在質譜圖上體現不出來,溶液樣品可以收集到,但是分子量越大檢索的結果越不準確;理論上圖譜的峰越多越好,要是都能匹配上那麼蛋白的確定程度就更高,相反就越低;一般至少要拿到4個肽段。
Q:如何理解這些片段峰值大小意義,越高(縱坐標值大)越精確嗎?以及這些酶解片段的數量及峰值一般應達到什麼標準才算比較好??
A:片段峰橫坐標的大小的意義是酶解下來的肽段的質量大小,縱坐標表示的收集的該肽段的相對的信號的強度,左邊是相對的,右邊是絕對的,絕對的越高,抗干擾的能力越好,質譜的精確度由儀器來決定的。我們的儀器的精確度在10ppm以內。
Q:圖譜上肽段多於8條,為什麼選這8條?
A:至於提交檢索的肽段的數量是根據肽段的信號強度來選取的,同時在軟體處理的過程中會過濾一部分峰, 如胰酶的自解峰等;
Q:資料庫檢索報告中m/zsubmitted,MH+matched兩項是什麼意思?
A:m/z submitted 的意思是您提交給資料庫的m/z值(因為質譜儀用m/z來分離樣品的), MH+matched指的是與你提交數值相匹配數值,因為在樣品在離子化過程中從基質中得到一個質子,所以它會加一個H
Q:這兩項的分子量和你們的圖譜上相應分子量不一致。
A:因為在用圖譜數據在資料庫檢索之前需要通過一個數據的校正和處理,所以圖譜上的值與提交檢索的值有區別圖譜中的峰值是經過一個軟體處理後的結果,主要是經同位素峰的合併圖譜上的結果會不一至的。
例如在你的圖上讀到的是1519.402,在看圖的時候把它給放大處理(只有我這裡的圖譜處理的軟體才能看到),就會發現存在1518.402、1520.402、1521.402、1522.402等相差1的質譜峰,這是由於在天然界中好多物質都存在同位素如O16、O17、O18等,所以在提交給資料庫之前會用一個類似於碳水化合物的通式進行校正,所以圖譜上讀到的數可能會與提交的相差1,還在處理的過程的設置也會影響給出的峰值,但應該在0.1Da以內的;同時在還會進行胰酶自解峰的扣除和空白對照峰的扣除。
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