曹雪濤組闡明新型長非編碼RNA介導固有免疫的反饋調節機制——徐平龍、侯法建點評

撰文 | 蓁 灼

點評 | 徐平龍（浙江大學生命科學研究院）

侯法建（中科院上海生化細胞所）

宿主的固有免疫系統通過模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs）感應入侵病原體激活免疫應答從而達到清除病原體的目的。針對於RNA病毒的入侵，RIG-I（retinoic acid-inducible gene-I）受體識別胞質病毒RNA併產生I型干擾素（type I interferons ，IFNs）及細胞因子【1,2】。然而，IFN的過度表達則會引發機體自身免疫性疾病的產生，因此，IFN的表達平衡調控是免疫學家關注的研究重點之一。

RIG-I的分子結構包含N端CARDs（caspase activation and recruitment domains， CARDs）結構域，DECH解旋酶結構域與C端CTD（C-terminal domain，CTD）結構域。靜息態的RIG-I分子以自身抑制狀態存在，其中CARD2結構域結合於解旋酶結構域的插入區；而當病毒的5』三磷酸雙鏈RNA入侵後，CTD結構域感應並結合RNA，使得RIG-I分子轉變為開放構象釋放CARDs結構域，介導下游信號傳遞與免疫應答【3】。因此，攜帶5』三磷酸的雙鏈RNA是激活RIG-I的要素之一【4】，然而RIG-1是否可以結合宿主自身RNA及其功能的研究目前處於空白狀態。

近年來，長非編碼RNA（long noncoding RNAs ，lncRNAs）通過與特定蛋白髮生相互作用而參與眾多生理病理過程的研究愈發引人注目。利用紫外交聯免疫共沉澱測序技術（high-throughput sequencing of immunoprecipitated RNAs after cross-linking，CLIP-seq）在人與小鼠中分別鑒定到21073與1662組RNA結合蛋白（RNA-binding protein ，RBP）- lncRNA互作關係【5】。然而，RBP-lncRNA互作關係在免疫與炎症中發揮的作用目前尚未有研究報道。2014年，曹雪濤團隊在Science發表研究論文，報道了長非編碼RNA–lnc-DC通過與轉錄因子STAT3相互作用促進其磷酸化從而調控人類樹突細胞分化的過程，拓寬了研究人員對lncRNA參與免疫細胞分化及功能的認知【6】。

4月26日，中國工程院院士、南開大學校長曹雪濤所率領的團隊在Cell雜誌在線發表了題為Self-Recognition of an Inducible Host lncRNA by RIG-I Feedback Restricts Innate Immune Response的研究論文，發現了一種起源於宿主自身的，IFN誘導的新型長非編碼RNA-lnc-Lsm3b，lnc-Lsm3b可與病毒RNA競爭性結合RIG-I單體，在免疫應答晚期發揮負反饋調節作用，抑制RIG-I的活性。機制上來說，lnc-Lsm3b通過其多價的長莖結構域結合RIG-I並阻止了其構象變化從而抑制了下游信號傳遞。BioArt還特別邀請了從事相關研究的兩位專家對上述工作進行精彩點評，以饗讀者！

在這項研究中，研究人員首先利用紫外交聯免疫共沉澱技術（UV cross-linking and RNA immunoprecipitation assay，UV-RIP）鑒定到了胞質lnc-Lsm3b，lnc-Lsm3b作為Lsm3基因編碼的唯一成熟性lncRNA，在RNA病毒感染宿主時表達顯著升高且可與RIG-I發生結合，同時IFN也可誘導lnc-Lsm3b的表達。隨後，lnc-Lsm3b在RNA病毒感染的巨噬細胞內可抑制RIG-I介導的免疫應答，阻抑IFN與抗炎因子的產生。與其他負調控因子在RIG-I信號通路早期發揮作用不同的是，lnc-Lsm3b阻止RIG-I引發的IFN的表達主要發生與抗病毒應答晚期。進一步地，研究人員在lnc-Lsm3b-/-敲除的小鼠中觀察到RNA病毒感染後，lnc-Lsm3b-/-敲除小鼠體內的IFN在18-24小時的表達顯著升高，且病毒滴度顯著減少，證明了lnc-Lsm3b主要在抗病毒信號級聯反應晚期有效抑制RIG-I的功能。

Lnc-Lsm3b參與RIG-I抗病毒信號通路主要是通過與RIG-I的CTD結構域發生相互作用，且lnc-Lsm3b與RIG-I的結合可以有效抑制病毒RNA-5』三磷酸雙鏈RNA結合RIG-I的CTD結構域。因此，RIG-I的CTD結構域作為兩種RNA重疊性結合區域可為兩者的競爭性結合提供分子基礎。機制上看，lnc-Lsm3b所擁有的多分支環狀結構為其與病毒RNA競爭性結合RIG-I提供結合條件。對於RIG-I的結合，Lnc-Lsm3b相比於病毒dsRNA擁有更高的親和效率，因此可以結合細胞內新合成的大部分RIG-I單體分子從而抑制信號的傳遞。

此外，研究人員探究發現，宿主自身對於lnc-Lsm3b的識別可以幫助RIG-I處於非激活狀態。lnc-Lsm3b通過穩定RIG-I分子內CARDs結構域與解旋酶結構域的相互作用，使得RIG-I分子在病毒刺激時處於自身抑制的結構，干擾了CARDs結構域與MAVS分子的相互作用。同時，在RNA病毒刺激中，由TRIM25介導的RIG-I K63泛素化在lnc-Lsm3b的作用下也受到抑制。因此，研究人員證實了宿主自身的lnc-Lsm3b是RNA病毒感染時RIG-I信號通路的強力負調因子。

總的來說，該研究的亮點在於不僅發現了一類新型的長非編碼RNA-lnc-Lsm3b並闡明了其抑制免疫反應過度激活的機制，為人體lncRNA與免疫分子的相互作用提供了研究思路，也為自身免疫性疾病的治療與預後奠定了研究基礎。

專家點評

徐平龍（浙江大學生命科學研究院教授，國家傑青）

Comments：核酸固有免疫識別機制及其誘導的干擾素（IFNs）以及後續的干擾素誘導基因（ISGs）的表達組成了脊椎動物重要的宿主防禦系統，在抵抗病原微生物尤其是病毒感染中起關鍵作用。過度激活的核酸免疫識別則誘導細胞死亡、衰老以及炎症、自身免疫等多種嚴重疾病。因此，宿主細胞對此「危險識別」系統有極為繁複的調控和保險機制，比如陳志堅實驗室2015年在Science報道的TBK1對其上游接頭蛋白MAVS、STING及TRIF的「逆向」識別與修飾，從而以信號的來源來決定信號的強度和廣度。但是，學界對核酸免疫識別信號的終止機制目前還所知相對甚少。

曹雪濤院士是核酸固有免疫識別調控機制的主要開拓者之一，尤其在鑒定該系統的表觀遺傳調控及蛋白修飾調控方面做出了一系列卓有成效的工作。曹雪濤院士最新發表在Cell的研究，以識別細胞質中異源RNA的受體蛋白RIG-I為對象，鑒定了干擾素誘導基因（ISGs）之一的長聯非編碼RNA lnc-Lsm3b是核酸免疫識別的重要調控元件。Lnc-Lsm3b能夠通過自我識別機制，利用其長莖及多枝環狀的特殊結構，作為誘餌富集多個RIG-I並限制其CARD結構域的開放，從而競爭性地抑制RIG-I對病毒RNA的識別，構成了核酸免疫識別機制後期的負反饋調控。這項工作不僅首次鑒定了lncRNA是核酸固有免疫識別及炎症調控的重要調控元件，也揭示了lncRNA在哺乳動物抗病毒中的關鍵功能，因此是核酸免疫識別調控以及lncRNA功能研究觀念上的重要突破。這項工作同時也進一步證實了RIG-I這一重要「異源」RNA受體也能夠有效識別並結合宿主細胞「自身」RNA，驗證了長期以來領域內的猜測。工作深化了我們對RIG-I這一關鍵RNA識別受體調控複雜性的認識，也提出了通過調節lncRNA進行抗病毒或抗炎症治療的創新思路。

由於lncRNA普遍的低丰度，其是否具有實質功能在業界仍然有非常大的爭論。曹雪濤院士的工作表明細胞內生成的約250個拷貝的lnc-Lsm3b，通過其「一對多」的結合特性，能夠富集宿主細胞內所有新誘導生成的RIG-I。這一有力證據從而給lncRNA的功能研究提供了重要啟示。

侯法建（中科院上海生化細胞所PI，青年千人）

Comments：干擾素信號通路在宿主細胞防禦病毒侵染中發揮重要作用，其中RIG-I是定位於細胞質中的模式識別受體，RIG-I結合病毒相關的RNA後激活下游信號通路、誘導干擾素的表達。干擾素通過誘導幾百個基因（ISG）的表達從而發揮抗病毒功能，RIG-I也是ISG之一。以前人們猜測，RIG-I在病毒感染後期的上調錶達可能會進一步放大抗病毒天然免疫反應，以徹底抑制病毒侵染。另一方面，過度的天然免疫反應可能導致過度炎症以及相關疾病，因此，近年大量的研究工作關注對RIG-I信號通路的下調。曹老師的工作（Cell,2018）發現了一個新的ISG，即長非編碼RNA lnc-Lsm3b，能夠抑制RIG-I的激活。

以前的結構生物學研究表明，RIG-I的N端結構域CARD與中間的解旋酶結構域以及C端結構域CTD相互作用，處於非活性的「封閉」狀態；RIG-I結合病毒RNA以後，釋放其N端的CARD結構域，從非活性的「封閉」狀態轉變為活性的「開放」狀態；而lnc-Lsm3b能夠穩定CARD與解旋酶結構域以及CTD結構域的相互作用，從而阻止其激活，表明相對於病毒RNA，RIG-I對lnc-Lsm3b具有更高的親和力。這項研究解釋了在病毒感染後期RIG-I作為ISG而不能誘導產生更多干擾素的現象。這是曹老師實驗室繼前期發現Siglec-G降解RIG-I後（Cell,2013），在RIG-I信號通路負調節領域的又一力作。

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