中國學者揭示細胞被動衰老以及衰老相關分泌表型調控新機制

責編 | 迦 漵

我們為什麼會衰老？

衰老的普遍機制是什麼？

為什麼腫瘤細胞能永生，正常細胞卻不能？

……

這些問題，現代生物學能回答嗎？

也許，我們已經有了部分的答案。

20世紀早期，人們曾經深信不疑，如果各種條件均恰當，在實驗室培養的細胞都能無限分裂。到了40年代，人們終於「成功」地獲得了永生細胞，比如大名鼎鼎的海拉細胞（HeLa，人宮頸癌細胞）。有人曾因此認為，正常細胞也有無限分裂的潛力，所以衰老似乎不應該是細胞內部出了問題，而是外界輻射或者細胞外一些分子的變化使細胞發生了交聯等異常情況所致。直到60年代，人們終於發現，實際上並不是什麼外界培養條件阻止了正常細胞的持續分裂，而是細胞本身就有一種內在的機制，限制著其持續分裂的次數。這一機制後來被稱為「Hayflick界限」【1】。

以人類細胞為例，最多可以分裂50代；而且越接近老年，細胞可分裂的潛力越有限。這種細胞增殖能力的下降，反映到器官和個體層次上就是機體老化。癌細胞發生了變異，並可在體外無限傳代，它們在培養條件下完全失去了接觸抑制，所以不受Hayflick界限的支配，因此被視為永生細胞。

那麼正常細胞為什麼不能永生呢？研究表明，端粒的平均長度隨著細胞分裂次數的增加及年齡的增長而變短。端粒DNA序列逐漸變短甚至消失，就會導致染色體穩定性下降，這可能是引起衰老的一個重要因素。許多證據表明端粒的長度控制著衰老的進程，而端粒似乎是一種觸發衰老的分子鐘，限制著真核生物DNA複製的能力。端粒酶（Telomerase）則是一種含有RNA鏈的逆轉錄酶，它以所含的RNA為模板來合成DNA的端粒結構。活化的端粒酶將會導致端粒DNA序列延長，大大延長細胞壽命。實際上，90%以上的正常組織細胞的端粒酶幾乎呈陰性，從而將這個酶與細胞的永生化和腫瘤聯繫到一起【2】。

然而，現實世界中還有比端粒縮短更為常見的情況，則是尚未因年齡增長就早已發生的多種條件下的細胞衰老。比較突出的是在臨床條件下經歷過各種化療藥物或電離輻射的腫瘤患者，在治療過程中或治療結束後開始出現除了腫瘤細胞大量凋亡之外，腫瘤微環境中佔據主體結構的基質細胞(良性，沒有突變，處於正常增殖或休眠態)開始呈現典型的衰老特徵，而此時這些細胞的端粒卻沒有發生明顯縮短。究竟是什麼原因導致臨床背景下人體微環境中的大量正常細胞提前進入衰老階段呢？

4月30日，中科院上海生命科學研究院孫宇研究團隊在Nature Communications雜誌在線發表了題為The senescence-associated secretory phenotype is potentiated by feedforward regulatory mechanisms involving Zscan4 and TAK1的研究論文，報道了藥物副作用引發DNA損傷在臨床治療過程中導致體內細胞發生被動衰老，並在誘導衰老細胞出現一種強烈、持續和長期的分泌表型（senescence-associated secretory phenotype，SASP，即衰老相關分泌表型）過程中的關鍵作用。

研究表明，相比於非基因毒藥物如長春鹼、紫杉烷類，直接或間解導致DNA損傷的氮芥、核苷類似物、各種烷化劑、鉑類化合物等，可以在造成細胞衰老的同時，高頻激發細胞的SASP表型【3】。其中，細胞為響應外界因素所造成的DNA損傷，會在短期內激活細胞核與細胞質中一系列信號通路，後者又可以在一組特定因子的作用下逐漸從急性脅迫階段過渡至慢性炎癥狀態，後者集中表現為伴隨腫瘤患者在抗癌治療結束之後很長時間、甚至此後終生的體內SASP。

長期以來，化療、放療和靶向治療等手段是臨床醫生對於腫瘤患者採取的主要治療方式。治療初期，多數患者對於藥物比較敏感，但隨後會逐漸進入一個治療瓶頸期，治療效果開始下降。即便患者可以堅持下來，也不可避免出現各種藥物的毒副作用，比如噁心嘔吐、口乾舌燥、食慾缺乏、手腳麻木、毛髮脫落、血細胞減少等，導致患者生存質量普遍下降。實際上，伴隨體征指數巨大變化的，則是體內微環境中已經發生的深刻改變，而脅迫性DNA損傷則是生理水平最本質、影響最深遠、臨床最常見、對患者治療效果影響最顯著的一種結構性或物理性傷害。

在這項研究中，研究人員首先利用細胞培養和全基因組表達譜（whole genome expression analysis）分析技術，鑒定到了體外條件下的人源基質細胞在多種化療藥物和電離輻射的作用下，出現比較典型的衰老特徵（顯微形態、細胞大小、核仁體積變化等細胞學特徵）和廣譜的外秘蛋白胞內合成、胞外釋放（經典SASP特徵）。然而，比多種SASP特徵性因子表達幅度更高的，則是一種名為Zscan4的胞內蛋白。這一現象，引起了孫宇團隊成員的高度警覺，因為根據已有的經驗，由DNA損傷引發的衰老細胞中應該不會有比SASP因子表達更為顯著的基因了；即便有，也會是目前已被發現、對於細胞衰老或SASP的形成具有重要意義的標誌蛋白如p53/p16/GATA4/IL-1α等【4-6】。但事實否認了這一所謂的先驗或者預測。

在此後時間裡，實驗室將Zscan4在衰老細胞中的表達規律和生化基礎作為重點研究內容之一。很快，他們發現Zscan4在細胞中的表達僅限於基因毒藥物引發的衰老，而非基因毒藥物不具備這一特徵；更為重要的是，Zscan4基因的表達非常迅速，即在DNA損傷後的很短時間內就能出現高度上調，跟目前已知的DNA損傷反應(DDR)複合體組分如ATM/NBS1/H2AX/53BP1的活化呈現平行關係，儘管在時間上稍微有些遲滯。伴隨Zscan4高度表達的，則是多種SASP因子的普遍合成和胞外釋放。

在這項最新研究中，孫宇團隊針對中國人群中一組非小細胞肺癌(NSCLC)患者的臨床組織樣本深入分析，並開創了一套基於特定蛋白體內表達水平的相對定量分析方法。他們發現化療後階段相比於化療前時期的患者，病灶中出現了Zscan4的顯著上調。更為重要的在於，Zscan4在患者組織中的表達，集中體現於腺體周邊的基質細胞，而非腺體內的上皮細胞。同時來自乳腺癌(LCa)的數據證實了這些發現，使得隨後的臨床研究模式同癌症研究領域絕大多數集中在上皮癌細胞的評估方法及其最終數據形成鮮明對比。在分析這些患者在療後階段的生存特徵時，研究人員發現，Zscan4在腫瘤患者基質細胞中的表達水平越高，臨床預後越差，總體生存期越短，暗示Zscan4具有重要的病例意義，但其治病機理卻是一個謎。

此後的實驗表明，在DNA損傷下的急性階段核內蛋白ATM發生磷酸化並從細胞核轉位至細胞質中，引發一系列胞質反應包括TRAF6泛素化、TAK1磷酸化和NF-κB活化併入核。Zscan4作為NF-κB驅動表達的一個鋅指蛋白，在胞漿內線粒體上合成為蛋白之後，再度入核，並結合到DDR修複位點上、參與到DNA單雙鏈的修復活動中。因此，ATM-TRAF6-TAK1-NF-κB-Zscan4實際上在受損基質細胞中形成了一個正向迴環（positive feedback），其中的Zscan4因DNA損傷事件而生，終又致力於DNA損傷修復中，是一個忠實的DDR相關因子。

就在幾年前，曾有Nature論文報道Zscan4在胚胎幹細胞(ESC)中可以發揮促進端粒延伸和基因組穩定性的作用；尤其特別的是，在任一時刻僅有5%的ESC表達Zscan4，而在連續9次傳代過程中幾乎所有細胞均至少表達一次Zscan4【7】。相比之下，孫宇團隊的這項發現顯然不同於以往的思路和結論，提出了Zscan4表達在時空上具有理化因素誘導性、不局限於特定發育階段的有力證據，為科學界今後進一步研究Zscan4對於DNA損傷、細胞衰老的重要意義提供了一個贊新的視野和堅實的開端。

團隊成員接下來發現，基質細胞在DNA損傷條件出現高度表達的Zscan4，對於ASAP（acute stress associated phenotype，急性脅迫相關表型）向SASP的過度起到關鍵作用，而在急性階段發生活化的TAK1則是介導這一過程的橋樑。發生磷酸化的TAK1可以在胞質中激活MAPK家族成員p38，後者通過 PI3K/Akt/mTOR信號通路，隨即形成近年剛被報道的IL-1α/NF-kB這一positive feedback loop【8】，和該研究最新發現的IL-1α/TAK1這一前饋環通路（注意，是又一條前饋環通路，不同於Zscan4所參與形成的那條）。因此，從急性階段的ASAP到慢性時期的SASP，有多個關鍵信號分子及其涉及的通路參與到最終表型上凸顯出來的SASP這一細胞非自主性、隨時間級聯性放大的炎性反應中（下圖）。

隨後的一組轉化醫學數據表明，TAK1這一激酶在準確控制SASP發生髮展方面具有良好的藥物靶向價值。以基質細胞和癌細胞共同移植到體內形成的移植瘤為模型，團隊成員發現相比於主要靶向癌細胞的化療自身，由化療藥物和SASP抑製劑構成的組合式療法，可以在一定時間內更加有效地引起腫瘤消退。相比於p38抑製劑SB203580和mTOR抑製劑RAD001，TAK1抑製劑5Z-7提供的治療效果實際上更佳，並且可以顯著延長荷瘤小鼠的有效生存期。

據悉，孫宇團隊長期致力於解析細胞衰老的深層機制，探索臨床條件下微環境中基質細胞SASP發生髮展的生物規律和靶向策略，目的是為將來臨床醫學更快實現精準化和個性化提供贊新的思路和前沿的技術。中科院上海生命科學研究院博士研究生張博逸和同濟大學醫學院/上海第十人民醫院符達研究員為共同第一作者，孫宇研究員為論文的通訊作者。

通訊作者簡介

孫宇，中國科學院上海生命科學研究院研究員，博士生導師。2005年獲得加拿大Dalhousie University博士學位，加拿大University of British Columbia產科與婦科學系、美國Fred Hutchinson Cancer Research Center博士後。2012至2014年在美國University of Washington醫學部先後擔任研究員、助理教授，同時任美國VA醫學中心聯邦研究員(PI, tenure track)。

主要從事臨床治療條件下DNA損傷引發腫瘤微環境基質細胞衰老、癌細胞獲得性耐葯及其協同靶向的新型干預等研究。發現放化療為代表的現代基因毒療法在激活和重塑腫瘤微環境中所起的脫靶作用，揭示了抗癌治療本身造成微環境脅迫性衰老並出現SASP這一現象的分子機制。提出SASP釋放到胞外的各種蛋白之間通過相互作用，共同促進癌細胞的各種惡性行為，尤其SFRP2對於WNT16B的興奮劑功能。揭示特異性抑制微環境的SASP可促進癌細胞凋亡，避免其獲得性耐葯，最終實現精準抗癌。

至今獲美國國防部青年科學家獎，入選中組部「青年千人計劃」，專長領域為逆境和脅迫環境下的分子和細胞生物學。近年來在Nature Medicine, Nature Cell Biology, Nature Communications，PLoS Biology, Oncogene, Clinical Cancer Research等雜誌發表論文30多篇，榮獲多項獎勵。現任Translational Medicine等國際期刊編委。

參考文獻

1.Gill Z, Nieuwoudt M, Ndifon W. The Hayflick Limit and Age-Related Adaptive Immune Deficiency.Gerontology2018;64:135-9

2.Malhotra S, Freeberg MA, Winans SJ, Taylor J, Beemon KL. A Novel Long Non-Coding RNA in the hTERT Promoter Region Regulates hTERT Expression.Noncoding RNA2017;4

3.Coppe JP, Patil CK, Rodier F, Sun Y, Munoz DP, Goldstein J, et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor.PLoS Biol2008;6:2853-68

4.Kang C, Xu Q, Martin TD, Li MZ, Demaria M, Aron L, et al. The DNA damage response induces inflammation and senescence by inhibiting autophagy of GATA4.Science2015;349:aaa5612

5.Orjalo AV, Bhaumik D, Gengler BK, Scott GK, Campisi J. Cell surface-bound IL-1alpha is an upstream regulator of the senescence-associated IL-6/IL-8 cytokine network.Proc Natl Acad Sci U S A2009;106:17031-6

6.Sharpless NE, Sherr CJ. Forging a signature of in vivo senescence.Nat Rev Cancer2015;15:397-408

7.Zalzman M, Falco G, Sharova LV, Nishiyama A, Thomas M, Lee SL, et al. Zscan4 regulates telomere elongation and genomic stability in ES cells.Nature2010;464:858-63

8.Laberge RM, Sun Y, Orjalo AV, Patil CK, Freund A, Zhou L, et al. MTOR regulates the pro-tumorigenic senescence-associated secretory phenotype by promoting IL1A translation.Nat Cell Biol2015;17:1049-61

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