4篇Science論文聚焦基於CRISPR的下一代診斷工具

2017年，美國布羅德研究所核心成員張鋒（Feng Zhang, 音譯）教授及其團隊開發出一種被稱作SHERLOCK（Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing）的診斷平台。它利用一種依賴體熱的擴增過程來提高臨床樣品中的DNA或RNA水平。一旦這種水平增加，他們利用第二個擴增步驟將DNA轉化為RNA，從而使得這種靶向RNA 的CRISPR工具的靈敏度增加了一百萬倍，而且這種工具能夠在幾乎任何環境下使用。

這種診斷平台的關鍵在於Cas13酶和RNA報告分子。Cas13經編程後結合到一段特定的RNA片段上。當Cas13a檢測到靶RNA序列時，它的無區分的RNA酶活性（即附帶切割活性）也會切割這種RNA報告分子，從而釋放可檢測到的熒光信號。

圖片來自Zhang lab, Broad Institute。

到目前為止，SHERLOCK的一個關鍵的初步步驟涉及從患者樣品中提取和分離核酸，這通常需要實驗室和經過培訓的人員，這使得很難在現場完成診斷。

為此，在第一項新的研究中，布羅德研究所成員Pardis Sabeti教授、Sabeti實驗室的研究生Catherine Freije和博士後研究員Cameron Myhrvold開發出一種更加簡單的方法，從而允許Cas13直接在唾液或血液等體液樣品中檢測它的靶標。相關研究結果發表在2018年4月27日的Science期刊上，論文標題為「Field-deployable viral diagnostics using CRISPR-Cas13」。

這種方法被稱作HUDSON（Heating Unextracted Diagnostic Samples to Obliterate Nucleases, 即對未提取的診斷樣品進行加熱來消除核酸酶）。它由對臨床樣品進行快速的化學和熱處理以便滅活某些會降解基因靶標的酶。這些經過處理的臨床樣品隨後通過SHERLOCK診斷平台進行檢測，最終的檢測結果（陽性或陰性）能夠在試紙條上很容易地觀察到。這一整套檢測流水線能夠在兩個小時內完成。

通過將HUDSON和SHERLOCK聯合使用，Sabeti團隊能夠直接在患者的唾液和血清樣品中檢測到登革熱病毒。這種平台還能夠檢測之前添加到健康血液和尿液樣品中的寨卡病毒顆粒。

此外，Sabeti團隊對用於SHERLOCK診斷平台的試劑進行設計，從而使得能夠更容易地更快地將多個相關的病毒（寨卡病毒、登革熱病毒、西尼羅河病毒和黃熱病病毒）彼此之間區分開來。當患者出現一種能夠由有多種病毒引發的一般癥狀（如發熱）時，這些改進是特別有用的。

Sabeti團隊進一步證實了SHERLOCK對僅在單個核苷酸上發生的突變---比如，這種突變能夠導致耐藥性或對更大的病毒傳染性---的極其敏感性。在當前的這項研究中，這些研究人員設計出能夠檢測與小頭畸形相關的寨卡病毒突變的測試方法。

Myhrvold回憶道，「在文獻中描述了這種特定突變大約一周後，我們對它進行診斷和測試，並且我們能夠在近期的寨卡疫情期間收集的患者樣品中檢測到它。 「這才是真正的理想：不僅能夠揭示人們感染哪種病毒，而且還能夠揭示這種特定病毒毒株的特徵以及它可能來自何處。」

在第二項新的研究中，布羅德研究所核心成員Feng Zhang 教授和他的團隊對SHERLOCK診斷平台進行一系列優化，開發出一種微型試紙條測試方法，在將試紙條浸入經過處理的樣品中後，就會出現一條線來指示靶分子是否被檢測到，從而允許用肉眼觀察到測試結果，而無需使用昂貴的設備。相關研究結果發表在2018年4月27日的Science期刊上，論文標題為「Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6」。

他們讓這種平台使用來自不同細菌種類的Cas13和Cas12a（以前稱為Cpf1）酶來產生額外的信號。此外，他們還添加了一種額外的CRISPR相關酶（即Csm6）來放大檢測信號，從而增加了SHERLOCK的靈敏度，並增加準確地定量確定樣品中的靶分子水平和一次測試多種靶分子的能力。

在第三項新的研究中，加州大學伯克利分校的Jennifer A. Doudna教授和她的團隊通過將CRISPR的功能與分子信號槍相結合，開發出一種簡單的方法。這種被稱作DETECTR（DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter）的新方法能夠實現靈敏而又準確的DNA檢測。相關研究結果發表在2018年4月27日的Science期刊上，論文標題為「CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity」。

Doudna團隊觀察到在某些情況下，Cas12a會變成一種DNA切碎機，將附近的任何單鏈DNA進行切割。但這不是濫殺濫傷。為了開始砍刀行動，Cas12a首先必須找到一個精確的DNA靶標。人們能夠通過添加一個告訴Cas12a尋找什麼的嚮導RNA分子來對這個靶標進行編程。

一旦Cas12a鎖定它的靶標並進行切割，它就會開始撕碎它能夠發現的所有單鏈DNA。但是為了讓這種系統變得有用，Doudna和她的同事們需要一種方法來觀察Cas12a何時開始這種分子殘殺，從而指示它已找到它的靶標。因此，這些研究人員使用了一種發光分子（一種易於發現的熒光分子），並且這種發光分子通過一種單鏈DNA與一種阻止這種發光分子發光的抑制分子連接在一起。當Cas12a開始砍刀行動時，它切割將這種發光分子和這種抑制分子連接在一起的單鏈DNA。這就移除了這種抑制分子，讓這種發光分子發光---一種研究人員能夠檢測到的信號。

Doudna團隊隨後利用他們的DNA偵探進行測試。通過與加州大學舊金山分校的Joel Palefsky博士及其團隊合作，他們尋找來自兩種致癌性HPV---HPV16和HPV18---的DNA信號。這些研究人員獲得了25份來自未感染上HPV、感染這兩種致癌性HPV中的一種和同時感染上這兩種致癌性HPV的人的DNA樣品。對HPV16而言，DETECTR對這所有的25份樣本都作出了正確的判斷。對HPV18而言，DETECTR正確地判斷了這25份樣品中的23份。Doudna說，它錯過的樣品信號比較弱，可能能夠通過設計不同的嚮導RNA加以改進。

針對這三項新的研究中，美國國家過敏症與傳染病研究所的Daniel S. Chertow在同期Science期刊上發表了一篇標題為「Next-generation diagnostics with CRISPR」的評論類型論文。

參考資料：

Cameron Myhrvold1,2,*,?, Catherine A. Freije1,2,3,*,?, Jonathan S. Gootenberg et al. Field-deployable viral diagnostics using CRISPR-Cas13. Science, 27 Apr 2018, 360(6387):444-448, doi:10.1126/science.aas8836

Jonathan S. Gootenberg1,2,3,4,5,*, Omar O. Abudayyeh1,2,3,4,6,*, Max J. Kellner et al. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science, 27 Apr 2018, 360(6387):439-444, doi:10.1126/science.aaq0179

Janice S. Chen1,*, Enbo Ma1,*, Lucas B. Harrington et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science, 27 Apr 2018, 360(6387):436-439, doi:10.1126/science.aar6245

Daniel S. Chertow. Next-generation diagnostics with CRISPR. Science, 27 Apr 2018, 360(6387):381-382, doi:10.1126/science.aat4982

轉化醫學：生物谷旗下轉化醫學專業平台

喜歡這篇文章嗎？立刻分享出去讓更多人知道吧！