相分離：細胞生物學的百萬美元難題

就如同水油相混，細胞里的不同成分也會相互分離，形成液滴，這就是所謂的「相分離」。生物學家發現「相分離」在細胞生物學中無處不在。

油滴藝術。| 圖片來源：Steve Pavlovsky/光液實驗室

撰文：Elie Dolgin

David Courson和Lindsay Moore抵達馬薩諸塞州伍茲霍爾進行暑期科研訓練時，原本打算利用這個機會學習新的實驗技術，並嘗試一下高端顯微鏡。作為研究生，他們從未想過自己將為解決一個困擾了科研人員長達25年的生物學問題提供新思路。

伍茲霍爾海洋生物實驗室的導師交給他們的任務是觀察線蟲卵中RNA和P顆粒（一種蛋白質）小球是如何形成的，這是一個困擾了生物學家很久的大難題。在拍攝小球形成過程時，Courson、Moore和他們的導師發現了一個非同尋常的現象，P顆粒像熔岩燈里的液滴一樣相互碰撞、融合。

只有液體才可能發生類似的現象。因此他們意識到，P顆粒並非大部分研究者所認為的那樣是固體核心，它們就好似油醋汁里的油滴，劇烈搖晃之後分散成很小的液滴，而後又很快地融合形成大液滴。

這個過程叫做「液-液相分離」，是工程學、化學、物理學中的基本概念。只要兩種液體間存在使它們分離的力，「相分離」就會發生，最常見的例子就是油漂在水面上。「相分離」在自然界中很常見，對於許多工藝至關重要。但是當時的Courson並未對此有很多了解，現在他已經是弗吉尼亞州歐道明大學的一名細胞生物學家了。當時他觀察到P顆粒像液體一樣融合的時候，他的描述是「那是一個乾淨迅速的過程，但是我並沒有意識到這一現象的意義」。

暑期科研課程時間較短，他們沒有時間就這一過程進行深入探索。但他們的導師——細胞生物學家Tony Hyman和他的博士後——生物物理學家Cliff Brangwynne在回到德國馬克斯·普朗克分子細胞生物學和遺傳學研究所（MPI-CBG）的實驗室後，進行了進一步的實驗。他們將充滿P顆粒的線蟲性腺放置在兩片薄玻璃中間，迅速將兩片玻璃擦過。在切力作用下，固體成分將被塗抹開，但P顆粒相互融合、滴落，就像傘上的雨滴一樣。

Hyman和Brangwynne此時意識到了這一現象的重要性。通過「相分離」，也許可以提供一種方式讓細胞內的特定分子聚集起來，從而在「混亂的」細胞內部形成一定「秩序」，Hyman表示生物學家此前從未嚴肅對待過這種方式，因此也沒有做過定量研究。「這是一個人們沒有想到問的問題。」他說。Hyman和Brangwynne在2009年發表了他們的研究結果。

自2009年之後，全球許多科學家都圍繞細胞內的「相分離」展開研究。「相分離」形成的液滴可以形成特定環境加速生物學反應，也可以將不需要的物質隔離開。「『相分離』屬於那種剛知道的時候，憑直覺你就會意識到它其實非常有道理的概念。」紐約城市大學高級科學研究中心生物物理學家Shana Elbaum-Garfinkle說。

「相分離」不僅是聽起來有道理，實際上它在生物中非常常見。細菌、真菌、植物、動物體內都能發現蛋白質和RNA液滴。「相分離」一旦發生在錯誤的時點或位置，就可能造成阻塞或者特定分子的病理性聚集（如神經退行性疾病相關的分子），一些形成不良的液滴可能與腫瘤和衰老相關（具體見「細胞內的『相分離』」）。「這一發現改變了我們對整個細胞生物學的認知。」Elbaum-Garfinkle說。

但有些研究人員認為現在說「相分離」在細胞中發揮重要作用，且可能與疾病相關為時尚早。他們認為這有可能只是化學相互作用的附帶結果，對細胞力學無明顯影響。「研究人員認為『相分離』在細胞中能發揮怎樣的作用不代表這些作用真的發生。」哈佛醫學院的細胞生物學家Tim Mitchison說，「這些現在只能說是想法或者假設，並不是真的證據。」

科研人員很想拿到實驗證據。「現在這是一個價值上百萬美元的重要問題，」密蘇里州華盛頓大學的計算生物物理學家Rohit Pappu說，「這到底是細胞產生『黏糊糊』分子的副產品，還是真的是大自然對於『相分離』的妙用？」

「相分離」研究史

早在1899年，美國細胞生物學家Edmund Beecher Wilson提出細胞質可能包括「多種液體的混合」，其中有「不同化學性質的懸浮液滴」。二十世紀九十年代，研究人員開始探索「相分離」是否可能與疾病或者細胞構架相關。

但這些理論始終未成為主流觀點。「因為它們絕大部分都是假設性的，」Harry Walter說， 「從邏輯上講這些理論說得通，但並沒有確切的科學證據。」 Walter退休前是加州退伍軍人醫療中心的一名化學生物學家。

有的生物學家曾在特定的人工條件下觀察到「相分離」，比如在製備蛋白質用於X線晶體學研究時。但他們並未對此多加關注，也沒有想到這些現象可能和細胞質分區構架相關。

因此，Brangwynne和Hyman 2009年發表的關於線蟲P顆粒的研究著實出乎人意料，不過各方對此的反應卻不盡相同。「即便是研究線蟲的生物學家對該報道的反應也不完全相同，有人認為這完全是胡說八道，也有人認為這項研究揭示了P顆粒的真正性質。」Dustin Updike說。他在緬因州MDI生物學實驗室研究蛋白顆粒功能。在相關領域學術圈之外，則很少有科學家注意到這一發現。不過，很快就有更可信的實驗證據證明「相分離」的確在細胞中發揮著重要作用。

2011年，Brangwynne在美國普林斯頓大學成立了自己的實驗室，他和Hyman以及Mitchison共同發現核仁也有此前發現的「液滴」現象。（核仁是細胞核的一部分，包含遺傳物質和多種蛋白質。）2012年，美國德州大學西南醫學中心結構生物學家Michael Rosen和生物化學家Steven McKnight各自領導團隊研究蛋白質和RNA分子，他們發現在試管中這些分子通過微弱的作用力形成小液滴或膠凍樣小圓斑。

與Brangwynne和Hyman之前的研究不同，2012年的兩項研究提示「相分離」能夠通過簡單的生物化學方法在試管內重現。「自此實驗室內進行』相分離』研究變得了容易了許多，也是從這時候開始，這個領域有了突破性進展。」Rosen說。

這股研究熱潮大約從2015年年初開始，當時加拿大多倫多兒童醫院的結構生物學家Julie Forman-Kay帶領團隊發現，一種可能影響精子功能的蛋白質在人體細胞內形成液滴。2015年底，已有多項研究發現動物蛋白質存在「相分離」現象。「我們把這段時期稱為『研究井噴』。」Elbaum-Garfinkle說，他當時是Brangwynne實驗室的博士後，也是當時研究熱潮中一篇論文的第一作者。

「研究井噴」期間研究的多種蛋白質與特定疾病相關。研究人員在一種運動神經元疾病，也就是肌萎縮側索硬化（ALS）中觀察到「相分離」。這是一種神經退行性病變，主要特點是控制運動的神經細胞中蛋白質異常沉積。研究觀察到沉積開始時這些蛋白質和其他分子混合，與周圍的細胞質分離開，形成小液滴。這些小液滴粘性逐漸變強，最終變得非常堅硬。「這就像將室溫下的液態蜂蜜放到冰箱里。」Paul Taylor解釋說。他是美國田納西州聖裘德兒童研究醫院的分子神經遺傳學專家，他觀察到四種疾病相關蛋白存在「相分離」現象。

賓夕法尼亞大學蛋白質生物化學家Jim Shorter說，這些是關於異常「相分離」可能使液體變為固體從而導致疾病的最早的證據。細胞需要「相分離」將細胞內物質區分開，但如果「相分離」異常或過度就可能形成更穩定更難逆轉的結構，這就可能導致疾病。

「相分離」在細胞中的作用

錯誤的「相分離」還可能導致其它幾種疾病。上個月，麻省總醫院的分子生物物理學家Susanne Wegmann和她的同事們發現阿爾茨海默病患者腦內異常沉積的tau蛋白也存在「相分離」。Wegmann說「相分離」可能是tau蛋白聚集的初始觸發因素，這個發現可能將不同的神經退行性疾病聯繫起來。

「相分離」異常還可能導致某些腫瘤。去年，麻省總醫院的分子病理學家Miguel Rivera和他的團隊發現了一種與尤文肉瘤有關的蛋白。這種蛋白聚集在與腫瘤發生相關的基因組附近時可以激活致癌基因表達，而異常的「相分離」就可能促使這種蛋白在這些區域附近聚集。在上個月在舊金山召開的生物物理學會年會上，聖裘德醫院的結構生物學家Tanja Mittag描述了為何一種蛋白質能夠將液滴內的致癌分子隔離並破壞，但一旦它發生突變就無法形成液滴，就有可能導致腫瘤發生。

綜合這些將「相分離」與腫瘤或神經退行性疾病聯繫起來的研究，Hyman和MPI-CBG的Simon Alberti提出，衰老相關疾病事實上也可能與細胞無法控制「相分離」相關。機體一直在努力保持正常細胞結構，但「在某個時點，整個體系就那麼失控了」，Alberti說。

除了造成細胞損傷，「相分離」對細胞也有保護作用。今年，Hyman和Alberti發現在低pH的壓力環境下，酵母細胞會啟動保護機制，重要蛋白會聚集成液滴。當pH回升後，這些液滴會分散開，細胞恢復正常的功能。這個研究結果與此前芝加哥大學的分子和演化生物學家Allan Drummond的研究吻合。Drummond的研究發現酵母細胞中另外一種蛋白在高溫情況下也會形成液滴以起到保護作用。

因此，Drummond說「相分離」可能是細胞感受環境刺激並進行反應的常用機制之一，就好像既是報警器，同時還能打開消防噴頭。

在人體細胞中，形成液滴更多的是一種細胞構架方式。去年，加州大學舊金山分校生物化學家Geeta Narlikar和她的團隊發現，「相分離」幫助封存人體部分基因組，這些基因組永久不會被激活，主要發揮結構性作用。香港科技大學結構生物學家Mingjie Zhang的團隊發現，幫助大腦細胞接收信號的一種細胞機制是通過「相分離」建立的。

投下一束光

這類研究開始逐步揭示液滴在細胞中的一些作用，但是它們並不能解釋為什麼細胞中有的物質會出現「相分離」而其它物質則不會。這讓包括Hyman在內的部分研究人員有些喪氣。「我們需要明確驅動『相分離』的分子原理。」他說。為此，研究人員就需要有能夠在活細胞中發現、控制、調節「相分離」的方法。用Brangwynne的話說：「我們需要工具。」

進入普林斯頓大學一座上世紀七十年代的混凝土樓房，在三樓一間漆黑的沒有窗的房間里，Lian Zhu正彎腰坐在顯微鏡前。電腦屏幕上顯示一個人體細胞里有一個紅色的液滴，每個紅點都代表可形成核仁的「相分離」後的蛋白質。

Lian Zhu是Brangwynne實驗室的PhD學生。她隨後用藍色激光照射細胞的某一位置，幾秒鐘之後，黑色背景中出現了新的液滴。她對核仁蛋白做了熒游標記，這些核仁蛋白和植物蛋白融合後，在藍光照射下便會與周圍同類型分子聚集。當聚集達到一定閾值就觸發了「相分離」。

這就是Lian Zhu研究的細胞中發生的現象。屏幕上，那些紅點在相互融合前不斷跳動。「這就好像魔術一樣。」 她說。通過改變光的劑量，Brangwynne的團隊能夠對活細胞內不同液體成分的聚集程度進行調控，使液滴出現或消失。Lian Zhu目前的研究就是通過這種方法記錄核仁液滴形成的條件，以探索為何「相分離」只發生在核仁的某一個部分而不發生在其它部分。

Brangwynne希望這項「光液滴（optoDroplet）」技術能夠為「相分離」領域的研究帶來新的活力。「目前我們已經逐步實現了在活體細胞內進行定量研究，這是此前只有在非活體條件下可達到的研究程度。」Brangwynne說。這將極大推動基礎生物學研究的發展。一旦知道了如何使液滴形成和破碎，科研人員就能在此基礎上進行藥物研發。

目前，已有一些旨在探索通過「相分離」手段治療疾病的公司成立。比如，今年初加州大學舊金山分校的細胞生物學家Ron Vale成立了一家初創公司，並已獲得種子資金用於藥物研發，藥物目標是破壞與神經退行性疾病（如運動神經元疾病、亨廷頓舞蹈病等）相關的RNA液滴。Taylor也有類似想法，正在與投資方洽談。他計劃成立的公司將使用一個目前還沒發表的工具「光顆粒（Optogranule）」識別藥物靶點，這個工具能夠再現細胞中「相分離」相關病理表現和過程。這項技術的發明能夠讓研究人員在數小時內在培養皿里觀察到神經退行性變的過程。

其他人則採用了一些指向性不那麼明確的藥物發現方法。比如，MPI-CPG的Hyman和Alberti對一小部分經批准的藥物進行了盲篩，希望找到那些可能使蛋白質聚集物趨於液態化的化合物。他們目前已找到了約50種，下一步他們就將研究這些藥物究竟是如何影響細胞功能的。

Brangwynne說「相分離」領域如果想要有真正的進步，研究人員需要明確液滴形成的規律，進而找到控制液滴的方法，「我們需要將目前的研究推進到下一個高度。」

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