Nanopore測序首次揭示RNA病毒天然基因組

RNA病毒的基因組通常是經過反轉錄為cDNA，再通過測序方法獲得的。而近日Nature發表了一篇題為「Flu virus finally sequenced in its native form」[1]的文章，報道了美國研究者使用Oxford Nanopore技術在檢測流感病毒天然基因組RNA中獲得的重大突破，該研究論文已經預印[2]。該研究的領導者、美國疾病控制和預防中心的微生物學家John Barnes說：「這是我們第一次真正開始研究原始狀態下的RNA病毒基因組的本質，這確實開闢了很多可能性。」

Nanopore direct RNA測序是基於mRNA擁有poly(A)尾巴的特點進行測序的，其adapter是一段包含10個T的核酸序列，可與mRNA上的poly(A)序列互補，再連接測序接頭，即可達到牽引mRNA到納米孔進行測序的目的（Fig.1A）[3]。

A型流感病毒的RNA基因組3』端和5』端各有一段12nt和13nt的保守序列，研究者巧妙地設計了一種針對流感病毒基因組負鏈3』端保守區的Nanopore測序接頭RTA（Fig.1B），從而實現了在Nanopore MinION上對流感病毒RNA的直接測序。

Fig.1（A）Nanopore direct RNA建庫測序示意圖；（B）基於流感病毒保守序列Nanopore測序接頭示意圖

為了驗證設計的RTA的有效性，研究者應用Nanopore MinION對從已感染的雞蛋尿囊液中提取的total RNA進行測序，結果表明該RTA接頭可以特異性識別流感病毒RNA，通過Nanopore測序獲得的序列能100%覆蓋流感病毒基因組，且99%的序列可比對到流感病毒基因組。

Fig.2 MinION和MiSeq在原始樣本中對PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS片段測序覆蓋度比較

MinION測序數據對流感病毒中的PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS等8個片段的覆蓋度均為100%，但3』端表現為更高的測序深度，說明測序是從3』端開始的（Fig.2）。研究還將MinION測序結果與MiSeq測序結果作了比較。

研究者指出，應用該方法還可以對在病毒生命周期中起重要作用的病毒mRNA和cRNA進行測序，這有可能識別和量化剪接類型並進行鹼基修飾檢測，而這些在以往的方法中是無法做到的。針對不同類型的RNA設計adapter並結合Oxford Nanopore測序可實現對RNA的靶向測序，大大增加了該技術的應用範圍。

未來組迄今已完成數十個Nanopore動植物基因組測序組裝，「百個Nanopore基因組計劃」正如火如荼地進行；後續會陸續購入通量更高的PromethION測序儀，並與牛津納米孔公司攜手推出「1000個中國人基因組結構變異檢測計劃」，共同開發Nanopore技術在生命科學領域的新應用。

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