冷凍電鏡的前世今生

冷凍電鏡的前世今生

17年諾貝爾化學獎

1. Dubochet 博士領導的小組開發出真正成熟可用的快速冷凍制樣技術，製作出不形成冰晶體的玻璃台冰包埋樣品，隨著冷台技術的開發，冷凍電鏡技術正式推廣開來

2. Joachim Frank發明單電子冷凍電鏡。此外，他對細菌和真核生物的核糖體結構和功能研究做出重要貢獻

3. Richard Henderson通過電子顯微鏡研究膜蛋白、細菌視紫紅質，並由此揭示出膜蛋白具有良好的機構，可以發生a-螺旋

冷凍電鏡簡介

冷凍電鏡，就是用於掃描電鏡的超低溫冷凍制樣及傳輸技術(Cryo-SEM)可實現直接觀察液體、半液體及對電子束敏感的樣品，如生物、高分子材料等。

樣品經過超低溫冷凍、斷裂、鍍膜制樣（噴金/噴碳）等處理後，通過冷凍傳輸系統放入電鏡內的冷台（溫度可至-185℃）即可進行觀察。

其中，快速冷凍技術可使水在低溫狀態下呈玻璃態，減少冰晶的產生，從而不影響樣品本身結構，冷凍傳輸系統保證在低溫狀態下對樣品進行電鏡觀察。

發展歷程

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冷凍電鏡誕生

當時的生物學家通過對生物大分子進行脫水處理，並在分子表面吸附一些重金屬染料，從而得到的圖像。顯然，這樣的圖像必然會喪失樣品的高分辨結構信息，不能直接反映出生物大分子的真實形貌。

為此，Robert Glaeser與 Kenneth Taylor提出了樣品冷凍的概念，他們用液氮將catalase蛋白的薄晶體進行冷凍，大大的減弱了電子束對蛋白的損傷。

2

玻璃態樣品誕生

冷凍樣品通用方法

在此基礎上，Jacques Dubochet等人研究出了目前公認的最早的一種行之有效的冷凍方法。

他們在Robert Glaeser 實驗室的基礎上，系統研究了冷凍條件對生物大分子的影響，發現當以約10000℃/s的速度迅速降溫時，生物大分子的結構不易破壞，且輻射損傷比較小，並首次得到了病毒顆粒在無序冰中的透射電子顯微鏡圖5,6（如圖所示）。

該技術解決了含水生物樣品在透射電子顯微鏡中觀察關鍵技術瓶頸，並 被沿用至今。

3

三個突破

1. 樣品製備：

通過利用薄膜碳層甚至石墨烯可以用更薄的冰層包裹分子樣品來提高信噪比。

2. 電子探測技術：

在電子探測器發展的推動下，CMOS（互補金屬氧化物半導體）感光元件應用使得探測器在一秒鐘之內獲得幾十張投影圖片。通過後期對樣品進行漂移修正，再把這幾十張圖片疊加起來，可大幅提高成像的信噪比。

2013年藉助K2相機將膜蛋白TRPV1解析至3.4 ?，更是直接將冷凍電鏡技術推進原子解析度時代

3. 計算能力和軟體演算法:

冷凍電鏡的模型重構需要對幾萬甚至幾十萬張投影圖片進行分析、組裝和優化。這就對計算機的計算能力和演算法提出了要求。

這種基於概率論的單顆粒三維重構演算法原理最早由耶魯大學的Frederick Sigworth教授於1998年提出，由SjorsScheres完善並開發成為實用的圖像處理軟體，並成為今天冷凍電鏡單顆粒結構解析的主流軟體包。

技術難點

冷凍電鏡還存在樣品減薄技術、高解析度結構的分析與建模、構向不均一性分析、體內結構研究等難點需要突破，讓我們拭目以待!

美編：欒小維

文字：欒小維

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