單細胞測序技術應用於疾病發病機制的研究
單細胞研究的核心問題其實是：為什麼要進行單細胞研究？這主要是因為如果將成千上萬個細胞混在一起進行研究，就會模糊我們對各個器官，以及組成這些器官的細胞之間異質性的認識。在此基礎上，單細胞測序技術即將成為疾病機制研究的重要手段，本期由長征醫院生殖醫學中心蔣忠新碩士帶來最新解讀——《細胞測序技術應用於疾病發病機制的研究——以腎臟為例》。
單細胞測序技術應用於疾病發病機制的研究——以腎臟為例
作者 | 蔣忠新
文編 | 二妮兒
美編 | Springfield
隨著DNA測序技術的跨越式發展，測序的通量更高，成本更低；微流體技術和熒光活細胞分選技術等不斷湧現的新型單細胞實驗技術，使全基因組及轉錄組擴增的效率大幅度提高。單細胞層面的研究，特別是單細胞轉錄組測序成為可能。
傳統上，我們一般根據細胞功能、解剖位置或標記基因（很少）對臟器的細胞進行分類，然而這些分類分出來的各群細胞不完全一致。而單細胞轉錄組測序允許研究人員監測成千上萬單個細胞中的基因調控。單細胞測序的應用可以回答疾病發病機制中的核心問題。它能夠提供四種不同類型的信息：
首先，單細胞測序可以基於細胞轉錄組層次重新對細胞進行分群。這種分析在前期研究中已經被應用到免疫、泌尿系統的多個器官，甚至已經應用到果蠅這樣的整個生物。這些研究發現了新的細胞類型，進一步確定了原有分類的各群細胞的標誌基因。
第二，單細胞分析有助於剖析常見疾病的機制。以腎臟為例，一般來說，醫生根據其發病時長（急性或慢性）或其靶結構（腎小球-腎小管）來分類腎臟病理過程，而這掩蓋了潛在的生物學發病機制。現有的轉錄組測序僅對某相似組織如近端腎小管細胞進行分析，單細胞測序可以跳出現有的細胞分類，進一步探究不同細胞類型，以確定新的細胞群在疾病發生中的作用。
第三，單細胞測序可以識別同一細胞類型的不同狀態。一般認為，終末分化的細胞具有有限的分化能力。成人的細胞大多在祖細胞階段進行終末分化。然而，細胞分化可能在集合管發育過程中或在成年後進行。例如，閏細胞（ICs）的亞型可以改變其功能，甚至起源於主細胞（PCs）的類幹細胞群可以持續在成人集合管中存在並對外部刺激做出反應，但這些細胞並沒有最終分化。
第四，當前的腎臟疾病模型不能區分原代細胞自主反應與二次細胞非自主反應。相反，單細胞特異性的表達譜有助於識別每群細胞中疾病相關基因突變。
概要速讀：本文是4月5日在《Science》上在線發表的長文，作者是來自賓夕法尼亞大學醫學與遺傳學部的Katalin Suszták。作者使用單細胞測序技術對小鼠腎臟的57979個細胞進行了測序。推斷在遺傳性腎臟病中，不同的基因突變可能會引起相同的細胞表達譜改變，進而使疾病狀態表現為相同的表型。同時，作者首次鑒定出成年小鼠腎集合管中的一類新的中間細胞群。細胞印跡分析和體內譜系追蹤顯示腎臟閏細胞和主細胞之間的轉變由Notch信號通路介導。在小鼠和人腎臟疾病，閏細胞轉變為主細胞，進而導致腎臟病中代謝性酸中毒的發生。
首先，作者從七隻健康雄性小鼠（每隻小鼠一隻腎）中分離並使用單細胞測序技術對來自全腎細胞懸液的共57979個細胞進行測序，並進一步分析了其中43745個細胞。聚類分析確定了16個不同的細胞群，每群有24-26482不等個細胞。
接下來，作者應用已知的和本次新鑒定出的細胞類型特異性標記基因，對腎臟細胞分類，並用以識別每個細胞群。小提琴圖代表性標記基因在16個主要細胞群上的表達水平。Y軸為對數化計數。第1、3、7群可進一步被分為不同的亞群。
然後，作者將早期研究所闡明的腎臟病致病基因（的同源基因）與細胞種類進行關聯（下圖黃色方塊）。分析闡明，特定的細胞群體由於具有不同的特定功能，其轉錄變化將導致特定的腎臟疾病。比如腎小管酸中毒（RTA）相關基因的小鼠同源基因僅由集合管的閏細胞（IC）表達，證實了這些細胞在酸鹼平衡中的主要作用（下圖A中間）
同時，作者通過單細胞測序觀察到了腎集合管的第三類細胞群trans。集合管由主細胞（PC）和閏細胞（IC）兩類細胞組成。而該trans細胞群卻同時表達IC和PC的細胞類型特異性標誌物。作者通過雙免疫熒光染色和原位雜交進一步驗證了該細胞類型的存在。同時，熒光譜系追蹤證明新細胞是PCs和ICs之間的一種過渡細胞類型。
那麼，這兩類細胞是怎麼通過中間態細胞轉變的呢？這種轉變又有什麼意義呢？作者對其機制進行了進一步研究。
為了進一步探討集合管細胞的轉變，作者鑒定了在PC和IC細胞轉變過程中表達水平改變的基因。表明Notch信號通路在ICs向PCs的轉變過程中被激活。Notch通過Notch配體或受體的表達調節相鄰細胞的分化。配體和受體的交替表達產生信號發送細胞(Notch-off)和信號接收細胞(Notch-on)。ICs高表達Notch配體如JAG1，而在PCs中表達水平較低。相反， Notch 2型受體以及它們的轉錄因子HES1 在PCs中高表達，提示PCs是集合管中接收Notch信號的細胞。免疫熒光進一步證實了Notch配體JAG1在IC細胞中的表達。
而後，作者構建了集合管特異性高表達Notch配體的成年轉基因小鼠，並觀察集合管ICs與PCs的比例是否產生變化。以驗證Notch通路確實能夠影響兩種細胞間的轉變。
由於有報道表明，腎臟疾病患者和動物模型的Notch表達升高。作者使用葉酸（FA）誘導的慢性腎臟病小鼠模型，以及人CKD散發病例活檢樣本進行進一步驗證，發現其IC和PC細胞之間的轉變確實失常。
IC-PC的轉變增多是否會產生一定的功能效果呢？由於集合管IC細胞是腎臟中酸分泌的唯一細胞，表達H+的轉運基因。編碼質子泵（如ATP6V1B1）的基因突變將導致代謝性酸中毒。作者發現，昏迷的小鼠腎臟疾病模型的血CO2水平（血清碳酸氫鹽和二氧化碳分壓的綜合測量）顯著降低，符合代謝性酸中毒標準。
綜上，這些數據表明，（I）IC到PC的轉變是由Notch配體（ICs）和受體（PCs）表達介導的，以及（II）向PC細胞的轉變是CKD小鼠模型和CKD患者代謝性酸中毒的可能原因。
[1]Park, J., et al. (2018). "Single-cell transcriptomics of the mousekidney reveals potential cellular targets of kidney disease." Science. 05Apr 2018. DOI: 10.1126/science.aar2131
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