孫瑩璞/頡偉/那潔合作團隊發表人類早期胚胎染色質調控研究——張勇、陸發隆點評

編者按：生物學中一個非重要的問題是一個受精卵如何逐步分裂發育成為不同類型的細胞、組織和器官，最近哈佛的多個團隊利用單細胞測序技術成功繪製了斑馬魚和非洲爪蟾早期胚胎髮育的基因表達圖譜，揭示發育生物學中的重大問題（里程碑丨3篇Science運用單細胞測序技術破解早期胚胎髮育之謎，打破發育生物學傳統認識）。由於材料的稀缺性，更具挑戰的莫過於人類早期胚胎染色質動態調控研究，而中國學者近年來在該領域的研究走在了世界前列。今年3月9日，Cell發表了劉江/陳子江/劉見橋合作團隊利用基於DNase I切割的liDNase-seq技術繪製了人早期胚胎髮育過程中的染色質調控動態圖譜，而今日頡偉/那潔/孫瑩璞合作團隊在Nature上利用改進版的miniATAC-seq技術發表的同類研究（兩篇論文投稿時間都是2017年7月份），兩項成果雖然由於技術手段的差異在結論上有部分差別，但是二者互為補充，共同描繪了人類早期胚胎髮育過程中染色質局部開放區域的精美全景圖。為了讓讀者更好的讀懂該工作的亮點以及重要意義，BioArt特別邀請到了近年來一直從事相關研究兩位專家對上述工作進行了細緻點評，以饗讀者！

點評丨張勇（同濟大學）、陸發隆（中科院遺傳發育所）

責編丨迦漵

5月3日，清華大學生命科學學院頡偉研究組、醫學院那潔研究組與鄭州大學第一附屬醫院孫瑩璞研究組緊密合作，在Nature雜誌發表題為Chromatin analysis in human early development reveals epigenetic transition during ZGA的研究論文，揭示了人類早期胚胎髮育過程中染色質變化與基因轉錄的密切關係。這一重要發現不僅有助於我們進一步理解人類胚胎髮育過程中染色質調控機制，也為研究體外受精、試管嬰兒等相關應用和胚胎髮育相關疾病提供了理論基礎。

人類的個體生命起源於受精卵，受精卵在胚胎髮育早期經歷了一系列劇烈的染色體重編程事件。近些年，以小鼠為模式生物的研究表明，胚胎染色體的重編程過程中，來源父母本染色體的開放狀態，高級結構以及其攜帶的表觀遺傳信息都發生了巨大的改變。這些改變能夠幫助介導基因組轉錄的重新啟動，塑造嶄新的全能性胚胎，並為之後的胚胎髮育和組織分化奠定基礎。

之前的報道發現，基因轉錄的關鍵調控元件通常坐落在染色質開放區域。這些調控元件與細胞類型特異的轉錄因子共同指導了細胞的命運決定和個體的發育。在人類胚胎髮育過程中定位染色質的開放區域能夠幫助我們鑒定這一過程的調控元件和重要的轉錄因子，並探究染色質的開放狀態改變與基因轉錄的關係。但是在人類早期胚胎髮育過程中，由於實驗材料的稀缺，染色體在全基因組水平上的動態變化過程，以及其對胚胎基因轉錄的影響還鮮有研究。

為了開展這一研究，清華大學頡偉組優化了現有的細胞染色質開放區域定位技術(簡稱為miniATAC-seq，Assay for Transposase Accessible Chromatin with high-throughput sequencing)，實現了在極少量細胞（最低可只用到20個細胞，而未優化前在小鼠中的實驗需要上百個細胞）水平上進行開放染色質區域的檢測。進而與鄭州大學第一附屬醫院孫瑩璞研究組緊密合作，揭示了人類早期胚胎髮育過程中開放染色質的調控規律。最後通過與清華大學醫學院那潔實驗室合作進行小鼠胚胎相關實驗，發現染色質調控規律在人和小鼠胚胎髮育過程中同時存在保守性和物種特異性。

通過對人類胚胎髮育中的開放染色質區域的研究，研究人員首先鑒定出了人體早期胚胎髮育過中可能的重要轉錄因子。通過和小鼠早期胚胎髮育調控的對比分析找到了物種保守和特異的轉錄因子。有趣的是，人體基因普遍是在受精後發育至8細胞時期才激活（小鼠中一般為2細胞期），而研究人員發現在基因組激活前的1到4細胞時期染色體上就存在大量的開放區域（下圖）。

人類早期胚胎染色體上存在大量的開放區域（從2細胞到8細胞期）

上述開放區域很多集中在CpG含量較高的啟動子區。研究結果顯示這種啟動子區的提前開放與未來的基因激活相關。然而令研究人員驚訝的是，很多遠端非啟動子區也有很強的開放性，並且這些區域富集轉錄因子的結合位點。然而這些開放染色質區域隨著全基因組轉錄的激活反而大量消失。隨後細胞在很多新的調控元件位置建立起開放染色質區域。

進一步研究發現，這些1-4細胞遠端開放染色質區域傾向於出現在母本染色體特異的DNA低甲基化區域。在小鼠胚胎中，這些DNA低甲基化區域也通常出現開放染色質，並且擁有一種參與轉錄沉默的特殊非經典組蛋白修飾H3K4me3。在小鼠基因組激活後，這種非經典修飾H3K4me3被擦除，同時伴隨著這些區域染色質的關閉（詳見：清華頡偉組和同濟高紹榮組在《自然》發表「背靠背」論文，揭示小鼠早期胚胎髮育的表觀遺傳圖景）。

研究人員提出，這種早期胚胎基因組激活前特有的開放染色質區域可能作為一種特殊的染色質海灣(chromatin harbor)可以暫時儲存轉錄因子。一旦基因座激活時，這些位點被關閉，轉錄因子可以釋放至啟動子區參與基因組激活。這種在人類和小鼠胚胎髮育中保守的染色質變化規律可能對於早期胚胎的基因組沉默以及隨後的合子基因組激活具有重要作用。

另外，研究人員還研究了兩種人體胚胎幹細胞(na?ve hESC和primed hESC)的染色質開放性，並發現na?ve 人體胚胎幹細胞更接近於人體早期胚胎的內細胞團（Inner Cell Mass)。因此，這項工作對於研究人類體內和體外多能性細胞具有重要的參考價值。

人類和小鼠早期胚胎基因組激活前後染色質開放性的調控模式

值得一提的是，去年7月13日，頡偉組和劉江組幾乎同時分別在Nature和Cell上報道了哺乳動物著床前胚胎染色體三維結構重編程過程（頡偉/劉江組背靠背在Nature和Cell報道哺乳動物著床前胚胎染色體三維結構重編程【專家點評】）。鑒於近日頡偉組和劉江組分別在人類早期胚胎髮育染色質調控動態方面的研究成果，可以推測他們在今後可能會聚焦人類著床前胚胎染色體三維結構重編程過程。

鄭州大學第一附屬醫院的孫瑩璞教授、清華大學生命學院頡偉研究員和醫學院那潔研究員為本文通訊作者，清華大學生命學院PTN項目博士吳婧怡（目前已赴哈佛開始博後階段的研究）、CLS項目博士生劉伯峰、博士後林自立、醫學院博士生王培哲以及鄭州大學第一附屬醫院徐家偉和姚桂東為本文共同第一作者。合作實驗室還有中科院李偉組。

專家點評

張勇（同濟大學生命科學學院教授）

Comments：近幾年頡偉教授發表了一系列重要的工作，在基因組層面上系統研究了小鼠胚胎早期發育過程中各種表觀遺傳信息的動態變化。在本周，頡偉課題組及合作者孫瑩璞、那潔課題組發表了人類著床前胚胎髮育過程中染色質局部開放區域圖譜。這項研究優化了ATAC-seq技術，分別對人類2細胞期、8細胞期胚胎及囊胚期的內細胞團繪製染色質局部開放區域圖譜，每個實驗僅使用了30-90個細胞。值得注意的是，這項研究在三原核胚胎中也做了上述時期的ATAC-seq實驗，並論證了三原核胚胎與正常胚胎在這些時期的染色質局部開放區域圖譜一致；此外，針對三原核胚胎，還做了1細胞期、4細胞期以及轉錄阻斷的8細胞期的ATAC-seq實驗。三原核胚胎在體外受精中較多發生，一般在臨床上被丟棄，沒有倫理問題，這就為研究人類著床前胚胎髮育過程中轉錄調控機制及表觀遺傳信息的動態變化提供了理想的材料。

這項研究有一系列重要的發現，其中特別有意思的一點是，在ZGA之前人類染色質上就已經存在大量的局部開放區域，並且其中很大一部分在ZGA之後變得不再開放，而這一轉變依賴於轉錄的發生。這項研究進一步論證在小鼠胚胎髮育中也存在同樣的現象，並且將這些區域與頡偉／那潔課題組和任兵／Arne Klungland課題組在2016年分別報道的non-canonical H3K4me3相關聯（清華頡偉組和同濟高紹榮組在《自然》發表「背靠背」論文，揭示早期胚胎髮育的表觀遺傳圖景）。非常漂亮的結論！

這項研究不僅繪製了人類著床前胚胎髮育過程中染色質局部開放區域圖譜， 而且論證了表觀遺傳信息在ZGA過程中的轉換在人類和小鼠中傾向於是保守的，是非常有意義的工作！

另外，今年3月份，劉江／陳子江／劉見橋課題組發表了基於DNase-seq技術的人類著床前胚胎髮育過程中染色質局部開放區域圖譜（Cell丨中國學者首次報道人類早期胚胎髮育染色質調控的動態圖譜——附三組專家點評）。這兩篇論文各有側重，共同繪製了人類早期胚胎髮育過程中染色質局部開放區域的全景圖。值得注意的是，這兩篇論文有一部分結論不一致（這與2016年在小鼠中發表的兩篇論文的情形類似），可能與DNase-seq與ATAC-seq這兩種技術的偏好性有關，也可能與數據分析的策略有關；這也意味著哺乳動物早期胚胎中染色質結構可能存在特殊性，值得後續進一步研究。

陸發隆（中科院遺傳發育所研究員）

Comments：哺乳動物生命從受精卵開始，生命程序除了DNA序列之外還包括了染色質的組成與結構等表觀遺傳信息。近年來表觀基因組的技術靈敏度的提升使得人們可以去觀察受精前後以及著床前胚胎髮育過程各個時期的表觀基因組圖譜。目前在小鼠中實現了對DNA甲基化、染色質開放性、組蛋白H3K4me3，H3K27me3和H3K9me3修飾以及三維摺疊的全基因組分析，通過這些分析對個體生命程序的展開以及受精前後的重編程有了初步的認識。

人類胚胎的相關研究受倫理與樣品量的限制對技術的靈敏度提出了更高的要求。因此此前對其表觀基因組的認識僅限於DNA甲基化。在染色質結構方面近期中國科學院北京基因組研究所劉江、山東大學陳子江和廣州醫科大學三附院劉見橋課題組合作採用NIH趙可吉和Harvard張毅實驗室開發的基於DNase I切割的liDNase-seq技術用50到100個人類胚胎細胞繪製了人早期胚胎髮育過程中的染色質調控動態圖譜（Cell丨中國學者首次報道人類早期胚胎髮育染色質調控的動態圖譜——附三組專家點評）。

在本期Nature中清華大學頡偉、那潔和鄭州大學第一附屬醫院孫瑩璞實驗室合作通過miniATAC-seq用30-80個細胞分析了人類早期胚胎的染色質開放性。與傳統的ATAC-seq相比miniATAC-seq的靈敏度提高了大約10倍。通過該方法本研究里分析了人胚胎1細胞期、2細胞期、4細胞期、8細胞期以及囊胚期的ICM的染色質開放性。在人里用ATAC-seq與DNase-seq兩種方法檢測染色質開放性與小鼠里觀察到了同樣的差異，進一步證明了在早期胚胎的染色質上存在可以被這兩種方法區分開的染色質結構上的差異。

與liDNase-seq觀察到的現象相似，以合子基因組激活（ZGA）時期為分界可以發現人和小鼠的胚胎染色質開放性（miniATAC-seq觀察）在轉錄激活前後有著驚人的相似性。在小鼠中，轉錄激活前遠端染色質開放區域與染色質上非典型的H3K4me3修飾位置重疊，而轉錄激活過程與遠端染色質開放性和H3K4me3重塑相關。小鼠中如果抑制轉錄，遠端染色質開放性和H3K4me3重塑不能發生。有意思的是在這裡看到的染色質開放性與非典型的H3K4me3的相關性不僅限於miniATAC-seq的信號，其他實驗室發表的liDNase-seq數據也顯現出同樣的相關性，雖然這兩種方法在早期胚胎中檢測到的富集的峰的數量上有很大的差異。

在人中抑制轉錄，遠端染色質開放性重塑不能發生，H3K4me3是否發生還沒有確切的實驗證據，但可以猜測很有可能與小鼠中一樣H3K4me3在合子基因組激活之前與染色質開放區域重疊且其重塑受轉錄激活過程調控。但相反遠端染色質開放程度以及H3K4me3是否影響合子基因組激活目前還不清楚。基於本研究的觀察，作者提出合子基因組激活前的這些開放區域可以作為一種特殊的染色質灣存儲轉錄激活所需因子用於之後的合子基因組激活事件。

這個發現的另一個重要意義是表明在早期胚胎髮育過程中合子基因組激活時期是受精後染色質重編程的重要分水嶺。因此有必要對合子基因組激活過程進行深入研究。這個發現與其相關未回答問題，即染色質與合子基因組激活之間的相互調控機理對我們認識哺乳動物個體生命起始有著重要的意義。

相信很快對全基因組組蛋白修飾的分析靈敏度能提高到100個細胞，這時候分析人類胚胎的組蛋白修飾圖譜將成為可能，從而可以進一步認識人類個體生命程序的展開時染色質所攜帶的表觀遺傳信息的變化與調控。

相關文獻合集：

1、Lu, F., Liu, Y., Inoue, A., Suzuki, T., Zhao, K., & Zhang, Y. (2016). Establishing chromatin regulatory landscape during mouse preimplantation development.Cell, 165(6), 1375-1388.

2、Wu, J., Huang, B., Chen, H., Yin, Q., Liu, Y., Xiang, Y., ... & Xie, W. (2016). The landscape of accessible chromatin in mammalian preimplantation embryos.Nature, 534(7609), 652.

3、Zhang, B., Zheng, H., Huang, B., Li, W., Xiang, Y., Peng, X., ... & Xie, W. (2016). Allelic reprogramming of the histone modification H3K4me3 in early mammalian development.Nature, 537(7621), 553.

4、Dahl, J. A., Jung, I., Aanes, H., Greggains, G. D., Manaf, A., Lerdrup, M., ... & Preissl, S. (2016). Broad histone H3K4me3 domains in mouse oocytes modulate maternal-to-zygotic transition.Nature, 537(7621), 548.

5、Liu, X., Wang, C., Liu, W., Li, J., Li, C., Kou, X., ... & Gao, S. (2016). Distinct features of H3K4me3 and H3K27me3 chromatin domains in pre-implantation embryos.Nature, 537(7621), 558.

6、Wang, C., Liu, X., Gao, Y., Yang, L., Li, C., Liu, W., ... & Gao, S. (2018). Reprogramming of H3K9me3-dependent heterochromatin during mammalian embryo development.Nature cell biology, 1.

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