許文濤：基於高通量測序技術的細菌非編碼RNA研究方法進展

非編碼RNA指細胞中不編碼蛋白質，而以RNA的分子形式起調控作用的一類核酸分子。真核生物中的非編碼RNA，如miRNA、piRNA、lncRNA等已經得到了深入的研究。相比而言，原核生物非編碼RNA的研究還處於初級階段。雖然細菌在進化上屬於比較低等的生物類群，但其所處環境複雜多變，決定了它們必須具有一套反應迅速的調控系統，因此非編碼RNA的調控作用對細菌來說至關重要。中國農業大學許文濤副教授在《生物技術通報》上發表綜述，對應用高通量測序研究細菌非編碼RNA的兩種主要技術RNA-seq和dRNA-seq進行了介紹，對現行的篩選非編碼RNA的生物信息學分析方法進行總結，並對該領域生物信息學分析策略的改進提出設想。

RNA-seq技術對細菌總RNA進行克隆測序的方法可以廣譜地發現新的非編碼RNA。然而由於細菌總RNA中95%以上的都是tRNA和rRNA，因此直接對總RNA進行克隆測序難以高效地得到非編碼RNA的信息。2009年Liu等首次報道了原核生物中穩定的rRNA和tRNA去除方法，從而實現了直接克隆的非編碼RNA-seq研究。dRNA-seq技術的原理如圖1所示，將總RNA分成兩份，其中一份直接進行測序，另一份中加入5』單磷酸依賴的外切酶（Terminator5』-phosphate-dependent exonuclease，TEX）處理，選擇性地降解5』端具有單磷酸的加工過的轉錄本，包括rRNA、tRNA以及部分降解的RNA片段，只保留5』端具有三磷酸的初級轉錄本，即未經加工的mRNA及非編碼RNA，再進行建庫測序。通過比較兩份樣品的測序結果，dRNA-seq技術可以有效地確定非編碼RNA的轉錄起始位點（Transcriptionalstart sites，TSS）以及mRNA的非編碼區（UTR）。

圖1.dRNA-seq技術的原理

在非編碼RNA的篩選與生物信息學分析策略方面，該文章認為表達丰度是細菌非編碼RNA篩選的先決指標，但由於不同研究中測序數據量的不同，表達丰度閾值只能依據研究對象具體情況而設定。序列對應在基因組中的位置是比較通用的細菌非編碼RNA篩選指標。當此指標篩選出來的潛在非編碼RNA過多時，研究者會利用轉錄信號、序列保守性等特徵進一步篩選，以縮小非編碼RNA的範圍。由於研究者對於非編碼RNA的二級結構、Hfq結合性等特徵的認識還不夠深入，因此目前還難以通過這些特徵對非編碼RNA進行篩選，只能對篩選出來的這些非編碼RNA特徵進行分析。

最後，許文濤副教授提出，目前除了「在基因組上的位置」這一非編碼RNA篩選條件外，難以發現非編碼RNA的其他普適特徵，這一瓶頸可能與細菌非編碼RNA的分類不清有關。解決這一問題可採用分而治之的思想。隨著人類對細菌非編碼RNA認識的不斷加深，可能找到某一種類型的非編碼RNA的統一特徵，將其特徵用於測序實驗結果的非編碼RNA篩選，可以更好地篩選出有特定功能的某一類非編碼RNA。例如，隨著人類對Hfq蛋白與非編碼RNA相互作用的認識不斷加深，可以總結出能與Hfq蛋白結合的RNA的序列或結構特徵，以此特徵為篩選條件，便可從測序數據中篩選出依賴Hfq蛋白的非編碼RNA。

點評：

雖然體外SELEX等技術可以篩選出大量的核酸適配體，但這些適配體在細胞環境內的活性往往有限，這嚴重阻礙了核酸適配體在微生物細胞感測器中的應用。對微生物自身非編碼RNA的深入研究，有利於總結細胞內功能核酸的結構特點，克服核酸適配體的細胞內外活性不同的壁壘。

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郭明璋, 許文濤. 基於高通量測序技術的細菌非編碼 RNA 研究方法進展[J]. 生物技術通報, 2015, 31(4): 99-104.

Sharma C M, Vogel J. DifferentialRNA-seq: the approach behind and the biological insight gained. Current opinionin microbiology, 2014, 19: 97-105.

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