草龜的抗腫瘤活性肽的分離純化及鑒定研究已證實

最新 05-07

草龜肉抗腫瘤活性肽的分離純化及鑒定研究

摘要：該研究選取草龜肉為原料，以其木瓜蛋白酶酶解所得多肽對人乳腺癌細胞 MCF-7 增殖的抑制功效為活性檢測指標，採用 MTT 細胞毒性實驗對具有抗癌作用的多肽組分進行追蹤測定。

先採用截留分子量 10 ku 的超濾膜對酶解液進行截留，再通過 Sephadex G-75、G-50 及 LH-60 等層析技術手段對截留所得活性成分進行分離純化。RP-HPLC 譜圖的結果表明，最終分離純化出了一個純度較高的抗癌活性組分 TP-1，其 IC50 值約為 2.7 mg/mL，呈明顯的抗癌劑量依賴性與時間依賴性，且對正常細胞毒性極小。

隨後通過紫外、紅外、圓二色譜對 TP-1 進行理化性質表徵，並採用質譜技術對該多肽主成分分子量進行鑒定。結果表明 TP-1 中含有 β 摺疊，β 轉角和無規則捲曲結構，且主成分多肽分子量約為 1410.7 u，本研究成果為進一步開展中華草龜活性肽的抗癌機理研究奠定了堅實基礎。

關鍵詞：草龜；抗腫瘤；抗癌；生物活性肽；分離；純化

報告詳情

眾所周知，在世界範圍內，癌症（「惡性腫瘤」）已成為首要死因之一，約佔所有死亡人數的 1/8，並顯著影響人口的變化[1]。儘管近年來化療藥物在治療癌症方面取得了較大進展，但依舊存在很多問題。據澳洲一項統計數據顯示[2]，治療性和輔助性細胞毒性化療對成人 5 年生存率的總體貢獻在澳大利亞為2.3%，在美國僅為 2.1%。

因此，根據一些新型作用機制研發新型高效抗癌藥物將成為當前的研究熱點，而生物活性肽（Biologically active peptides，BAP）抗癌活性尤為突出，且在很大程度上優於傳統的化療藥物，對於解決傳統化療藥物的弊端具有重要的意義[3]。

生物活性肽本身是一類由母蛋白通過酶水解、腸道消化或食品加工而釋放出來的具有生理和激素調節作用的多功能肽[4]。

研究表明，通過酶解蛋白獲得的生物活性肽具有抗菌、抗氧化、抗增殖和抗誘變等活性，正是這些活性使得其具有抗癌潛能[5]。

隨著研究手段和方法的不斷提高以及蛋白質工程和酶工程技術的迅速發展，特別是免疫活性肽與抗癌活性肽研究的不斷深入，未來生物活性肽的開發和利用將具有廣闊的前景

中國草龜（Chinemys reevesiis）又名烏龜，草龜，泥龜等，屬龜鱉目（Testudinate）龜科（Emydidae）烏龜屬（Chinemys），生活在淡水水域，分布於全國各地。中華草龜既是一種美味可口和營養價值高的珍貴佳肴，又是一種具有重要醫療價值的藥物[7]。傳統中醫認為，中華草龜對癌症具有輔助治療效果[8]，但這一效果至今尚未得到科學證實，有待進一步研究。

近年來，國內對龜類抗腫瘤的研究一直處於匍匐前行狀態，目前僅有從金錢龜（Cuora trifasciata）中提取抗腫瘤肽的報道[9]，因此從中華草龜中提取抗腫瘤活性肽對龜類在抗癌領域的發展具有重要意義。

在前期的研究中，我們利用單因素和正交試驗法獲得了酶法提取中華草龜抗腫瘤粗提肽的最佳條件[10]。本文進一步採用分離純化和活性檢測相結合的方法對該粗提肽的有效成分進行篩選，最終得到組分較單一的抗癌活性肽。該研究可為抗癌先導藥物的研發以及中華草龜的深加工提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

中國草龜龜肉的抗腫瘤活性肽酶解產物凍乾粉，自製[10]。製作方法：稱取一定量的龜肉，勻漿後用木瓜蛋白酶酶解，酶解時間 8 h，pH 7.5，溫度 60 ℃，加酶量 0.5%（4000 U/g），料液比 3:1。酶解結束後沸水浴滅酶 6 min，冷卻後過濾，濾液在 8000 r/min 的轉速下離心 15 min，取上清液冷凍乾燥成粉末備用。

1.2 主要試劑

胎牛血清（優級純），美國 Hyclone 公司； RPMI-1640 培養基，美國 Hyclone 公司；DMEM 培養基，美國 Hyclone 公司；胰蛋白酶，美國 Sigma 公司；青黴素-鏈黴素，美國 Gibco 公司；MTT，美國 Sigma 公司；DMSO，美國 Sigma 公司；細胞培養瓶，美國 Costar 公司；96 孔細胞培養板，美國 Costar 公司；Sephadex G-75、Sephadex G-50、Sephadex LH-60，北京拜爾迪生物技術有限公司；TRIS，北京索萊寶科技有限公司；一級色譜純乙腈，四友精細化學品有限公司；三氟乙酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他試劑均為分析純（AR）。

1.3 癌（腫瘤）細胞株

人乳腺癌 MCF-7 細胞株和小鼠成纖維細胞 L929，均購自中科院上海生化細胞所。

1.4 儀器與設備

LDZX-30KBS 高壓滅菌鍋，上海申安醫療器械廠；CKX41 倒置顯微鏡，日本 Olympus 公司；Varioscan Flash 酶標儀，美國 Bio-Rad 公司；VTGD1312 細胞培養箱，美國 Shell Lab 公司；ZHJH-C1112C 型超凈工作台，上海博通化學科技有限公司；FD-1B-50 冷凍乾燥機，北京博醫康儀器有限公司；

CT15RT 冷凍離心機，上海天美；8400 超濾杯/10000 u 超濾膜，美國 Millipore 公司；YC-2 層析實驗冷櫃，北京博醫康實驗儀器有限公司；Φ 3.2×75 cm 層析柱，上海琪特分析儀器有限公司；CBS-C 多功能全自動部分收集器，上海滬西；BT-200B 數顯恆流泵，上海滬西；Φ 4.6×250am Symmetry C18 反相色譜柱，美國 Waters 公司；

2695 高效液相色譜儀，美國 Waters 公司；Nicolet 67 傅里葉紅外光譜儀，美國 Thermo Nicolet 公司；J-810圓二色光譜儀，日本 Jasco 公司；液相色譜-飛行時間質譜儀，美國 Waters 公司；L-8900 氨基酸全自動分析儀，日本 HITACHI 公司。

1.5 實驗方法與內容

1.5.1 細胞毒性檢測

製備 MCF-7 細胞懸液，以 1×104 個/mL 接種於 96 孔細胞培養板，每孔 180 μL，置 5% CO2、37 ℃貼壁培養 24 h；隨後加入相應濃度的中華草龜抗癌成分（同時設立 PBS 對照組）繼續培養 24 h；加入 5% MTT 20 μL，再繼續培養 4 h；吸棄培養液，加入 150 μL DMSO 充分振蕩 10 min；最後置酶標儀上，在波長 570 nm 處測定吸光度 A 值，按公式計算細胞增殖抑制率，即IR%=(OD 對照組-OD 實驗組)/OD 對照×100%[10]。

1.5.2 酶解液超濾分級

本實驗採用截留分子量為 10 ku 的超濾膜進行超濾。在常溫下，以氮氣（N2）為加壓氣體，設定 0.2 MPa （表壓）壓力進行操作，分離後收集對應組分的濾液，冷凍乾燥後通過細胞毒性檢測實驗（即 MTT 法）分別測定其對癌細胞的生長抑制率。

1.5.3 氨基酸總含量檢測

根據細胞毒性檢測實驗結果，超濾組分在 10 ku 以下部分有較高的細胞毒性，所以選擇龜肉、龜肉酶解液和 10 ku 以下超濾組分的凍干樣品進行氨基酸組成及對應各種氨基酸含量百分比的檢測分析，並進行相互比較。

具體操作方法為：精確稱取樣品 0.01 g，溶於蒸餾水，並定容至 100 mL；取 1 mL 置安瓿瓶中，加2 mL 6 mol/L HCl（色氨酸 Trp 未測定）後充滿氮氣，在酒精噴燈下快速密封，並放入 110 ℃烘箱中水解 24 h；水解完全冷卻後，在 70 ℃水浴鍋中揮發鹽酸，雙蒸水洗滌 2~3 次，並蒸干；用適量 pH 2.20 的緩衝液溶解。定容；最後用 0.22 μm 微孔濾膜過濾後上機檢測[11]

1.5.4 葡聚糖凝膠柱層析

採用 Sephadex G-75，Sephadex G-50 和 Sephadex LH-60 柱對龜肉酶解液進行分離純化。Sephadex G-75和 Sephadex G-50 柱的條件是：採用蒸餾水進行洗脫，流速 0.8 mL/min，上樣量為 10 mL（約含 500 mg 蛋白樣品）；Sephadex LH-60 柱的條件是：洗脫液為甲醇/水混合溶液，並採用梯度洗脫（甲醇含量從 10%逐漸升高至 100%沖柱）。

自動收集器每管收集時間 4 min，收集體積 3.2 mL，檢測波長 280 nm，自動收集器配置Collection version 2.5 版本的核酸蛋白檢測系統軟體，收集數據後進行蛋白圖譜分析。1.5.5 反相高效液相色譜採用 Symmetry Shield RP C18 5 μm 柱，洗脫液 A為 100%雙蒸水（含 0.1% TFA），洗脫液 B 為 100%乙腈(含 0.1%TFA)，洗脫條件為：0~5 min，0% B；5~20 min，30% B；20~30 min，70% B；30~35 min，0% B。

洗脫液流速：2 mL/min。檢測波長 215 nm，柱溫 30 ℃。樣品上樣量為 50 μL，上樣前用 0.22 μm 微孔濾膜過濾[12]。

1.5.6 紫外掃描吸收圖譜

將純化以後的多肽組分配製成濃度為 0.10 mg/mL 樣品，用酶標儀在 200~380 nm 波長掃描紫外吸收波譜。

1.5.7 紅外圖譜

對經初步分離純化得到的多肽組分，與一定量的 KBr 混合後置於瑪瑙研缽內研磨成細微粉末，裝樣手動壓片，用傅里葉變換紅外掃描儀在 4000~400 cm-1 範圍內進行掃描。

1.5.8 圓二色圖譜

多肽樣品配製成 0.20 mg/mL 溶液，取 450 μL 溶液將光徑為 1 mm 的比色皿充滿，設定掃描速率 100 nm/min，掃描 180~280 nm 的圓二色譜圖。

1.5.9 主成分多肽分子量測定

對 TP-1 組分中的主成分多肽進行分子量測定。經 UPLC 分析後的樣品流穿過電噴霧界面進入質譜儀，霧化氣和乾燥氣均為高純氮氣，採用正離子掃描模式，在質/核比（m/z）350~1800 範圍內進行掃描[13]，最終獲得主成分多肽分子量。

1.5.10 活性肽 IC50 值

經過 Sephadex LH-60 純化得到三個多肽組分，分別對其進行乳腺癌 MCF-7 癌細胞的毒性檢測實驗，同時考察活性肽對正常小鼠成纖維細胞 L929 的毒性作用，最後計算活性最好組分峰Ⅰ的 IC50 值及其對時間（選擇濃度 1 mg/mL）和濃度的依賴性。

1.5.11 數據處理與統計方法

數據處理採用 Microsoft Excel 2007，圖表的繪製採用 Excel 2007 以及 OriginPro 8.5。

2 結果與討論

2.1 氨基酸檢測結果及分析

通常情況下，小肽類分子的氨基酸組成及一定量的螺旋或摺疊直接決定了活性肽的生理功能，如抗氧化活性肽和 ACE 抑制活性肽等[14]。在這些小肽分子中，少數幾個氨基酸出現的幾率要遠高於其餘的氨基酸。

由表 1 可知，中國草龜龜肉經酶解、超濾，並凍干後，大部分氨基酸佔總氨基酸比例呈現出較大的變化。但總體上來說，具備以下特點：亮氨酸（Leu）、甘氨酸（Gly）、賴氨酸（Lys）、丙氨酸（Ala）、異亮氨酸（Ile）、纈氨酸（Val）、胱氨酸（Cys）等七種氨基酸含量遠高於其餘氨基酸，氮端（N-）氨基酸序列中，甘氨酸（Gly）、亮氨酸（Leu）、賴氨酸（Lys）、丙氨酸

（Ala）、胱氨酸（Cys）出現頻率較高，碳端（C-）序列中，賴氨酸（Lys）、亮氨酸（Leu）、丙氨酸（Ala）、甘氨酸（Gly）、胱氨酸（Cys）、纈氨酸（Val）出現頻率較高，該結果符合 Tyagi [15]報道的抑癌抑菌活性多肽的特點。

那些對抗腫瘤活性肽的生物活性有重要影響的氨基酸種類（標★），其含量百分比均位於前列，這在一定程度上提示了龜肉蛋白有潛在的抗腫瘤作用。此外，三種樣品中的谷氨酸含量均為最高，且通過酶解及超濾處理可使樣品中的疏水性氨基酸比例趨於增加。

根據 Chalamaiah 等的研究結論[16]，抗癌肽的疏水性氨基酸含量一般較高，而且帶電氨基酸（如谷氨酸）對活性肽抗癌性質的形成有重要作用，其含量通常也較高。由此可見，酶解和超濾處理對後續抗癌肽的獲得和篩選具有重要的意義。

2.2 柱層析純化結果

根據抗癌活性檢測結果，超濾組分在 10 ku 以下

的部分有較高的細胞毒活性，因此選擇分子量小於 10ku 的組分進一步進行分離純化，依次採用 G-75 葡聚糖層析、G-50葡聚糖層析、羥丙基葡聚糖凝膠Sephadex LH-60 層析篩選抗癌較單一組分，分離過程中採用細胞毒性實驗對抗癌組分進行追蹤。

本研究根據多肽分子大小和極性對樣品進行分離命名為峰 A 和峰 B；細胞毒性檢測結果顯示峰 A 對純化。在多肽的分離純化過程中，採用多種技術聯用，不僅可以揚長避短，優勢互補，節約時間，而且可提高分離的效果和精確度[17]。

由圖 1 可知，酶解液 10 ku以下組分經過 Sephadex G-75 柱圖譜分離得到兩個峰，命名為峰 A和峰B；細胞毒性檢測結果顯示峰 A 對 MCF-7 抑制率較高Sephadex G-50 柱， MCF-7 抑制率較高（53.57%），所以選擇峰 A 組分過Sephadex G-50 柱,又分離出兩個峰，命名為峰 a 和峰b,細胞毒性檢測結果顯示峰 b 對 MCF-7 抑制率較高（55.26%），

因此選擇峰 b 組分過 Sephadex LH-60 柱，進行梯度洗脫，最終分離得到三個峰，依次命名為峰Ⅰ、峰Ⅱ和峰Ⅲ，且各峰區分程度明顯，分離效果良好；細胞毒性追蹤結果顯示峰Ⅰ、峰Ⅱ和峰Ⅲ組分對正常小鼠成纖維細胞 L929 的毒性均較小，但對乳腺癌細胞 MCF-7 的毒性均較大，其中峰Ⅰ顯示出了最強的細胞毒性，其最大抑制率（IR%）可達 80%以上，將該組分命名為 TP-1（tortoise peptide-1）。

從細胞毒性實驗結果可以看出，隨著不同分離純化步驟的依次進行，所得活性組分的抑癌效果逐漸增強，表明酶解粗提物中的抗癌活性組分得到了充分提取，同時也表明本研究所選的分離純化手段是科學可行的。

2.3 活性組分紫外、紅外、圓二色譜表徵

TP-1 組分進行紫外吸收全波長掃描、紅外掃描和圓二色譜表徵，其結果分別見圖 2、3 和 4 所示。

由圖 2 可知，該組分在 220~280 nm 表現出肽鍵的強吸收，表明產物中存在芳香族氨基酸，這也是典型的蛋白質和多肽的特徵吸收[18]。

由圖 3 可知，在 1650~1230 cm-1 處的吸收峰為醯胺鍵的特徵吸收，3276~3400 cm-1 處的吸收峰可能是O-H 和 N-H 的伸縮振動，673 cm-1 和 1061 cm-1 可能是 -NH2 的吸收，在 2986 cm-1 處的吸收可能是-CH3 的伸縮振動，而醯胺Ⅰ帶和醯胺Ⅲ帶通常是由 α-螺旋、β

摺疊、轉角和無規則捲曲的疊加共同作用所產生的吸收帶，蛋白分子氨基酸之間含有大量肽鍵，且由於羰基鍵的伸縮振動，導致了醯胺Ⅰ帶的特徵吸收峰通常位於 1600~1700 cm-1 處[19]。圖中 1650

cm-1 附近處有C=O 伸縮振動（醯胺Ⅰ），此振動可形成無規則捲曲；多肽結構中醯胺Ⅲ帶的特徵吸收通常位於 1340~1220 cm-1，圖中 1241 cm-1、1230 cm-1 處的吸收表明，該多肽結構中的醯胺Ⅲ帶有 β 摺疊的存在。紅外圖譜結果為精確分析多肽結構提供了一定的參考價值，結合後續的質譜技術可基本確定多肽化學結構[20,21]。

Greenfield[22]在利用圓二色譜對蛋白質和多肽二級結構預測中總結出了不同二級結構（α-螺旋、β 摺疊、轉角和無規則捲曲）所對應的典型特徵吸收譜圖，β-轉角在 180~190 nm 範圍內會呈現負峰，無規則捲曲一般會在 200 nm 呈明顯負峰，結合圖 4 及 Greenfield 的結論，

提示了 TP-1 組分中 β-轉角及無規捲曲構象結構含量較高[23]，該結果和前面紅外光譜分析得出的無規則捲曲結論相吻合。綜合考慮，該活性肽可能同時存在 β-轉角，β 摺疊和無規則捲曲，然而正是這些二級結構共同決定了該多肽組分的生物活性[24]。

2.4 RP-HPLC 圖譜

RP-HPLC 分析結果如圖 5 所示，在保留時間約為10 min 時得到 TP-1 組分的主要多肽成分，其含量明顯高於其他多肽含量，且由圖 5 也可以看出，該組分中雜質成分極少，純度較高。

2.5 質譜法對主成分多肽分子量測定

收集 TP-1 組分，採用 UPLC 串聯 NSI 噴霧質譜儀進行分子量測定。質譜儀自動對來自 UPLC 的洗脫組分交替進行一級質譜（MS）和二級質譜（MS/MS）處理，藉助分析軟體和蛋白資料庫，可對各組分進行分子量測定[25]。

質譜結果如圖 6 所示，結果顯示 MH+為 1411.7 u，經計算得出該組分（TP-1）中主成分多肽分子量約為 1410.7 u，其屬於低分子量短肽。通常，低分子量肽易於消化吸收且具備較多生理功能，如抗癌作用[16]。

目前，從水生生物中已提取出來少量抗癌肽，如 Hsu 等[26]從金槍魚的暗色肌中提取出了分子量分別為 1206 u 和 1124 u 的兩種短肽，其對人乳腺癌細胞 MCF-7 具有較強的抑制作用；Sheih 等[27]從藻類中提取出了分子量為 1309 u 的短肽，其對人胃癌細胞 AGS 有較強的抑制作用。