應用全外顯子測序發現男子不育症新致病基因

背景介紹

不孕不育症，是指成人男女雙方同居一處並有正常性生活一年以上，無避孕措施仍無法懷孕，影響全球高達15％的夫婦，大約50％的不育症是男性因素，由各種生精異常引起。最嚴重的是非阻塞性無精症（NOA），儘管生殖器官沒有阻塞，但完全沒有精子。非阻塞性無精症占男性不育症的10%-15%，因此約有1%的成年男性都受該病影響。

NOA的典型臨床評估包括收集病史排除隱睾症，腮腺炎性睾丸炎，之前是否接受過放療和化療，並進行體格檢查以排除可能導致精子缺乏的阻塞性原因。隨後的實驗室檢查包括精液分析，激素評估，染色體異常檢測和Y染色體微缺失檢測。以上這些評估和檢查只能解釋NOA病例約30％的原因，通常大家認為，許多特發性病例具有遺傳原因，人類已經發現有55個基因變異與NOA密切相關，在小鼠模型中已經發現有數百個基因影響精子生成，之前很少研究涉及遺傳性因素究竟在NOA佔到多大的比例。尋找特發性男性NOA遺傳因素的挑戰在於其高發病率表明高度遺傳異質性。因此，在沒有血緣關係的群體中，需要招募大量受影響的男性，以找到可能共有相同致病突變或罕見的破壞性突變，這些基因一般位於精子生成的信號通路上，並且具有多物種保守性。與之相對的是，如果是近親家庭結婚引起的NOA，則通過二代測序技術一個家系就可能找到致病基因（遊俠補充：該測序策略同樣適用於其他遺傳病）。

基於以上認識，我們覺得應用全外顯子測序（WES）應該可以在近親家庭中發現新的NOA致病基因，我們的方法包括兩個部分，第一是在近親大家系中發現新致病基因，第二是在散發患者中檢測已知基因和新發現基因的攜帶情況。

入組患者

8個大家系33名患者，75個NOA散發患者，74個正常對照。

測序與分析

採用Agilent V5進行捕獲測序，平均測序深度94.6X，排除以下位點1）不符合家系共分離位點；2）正常人群頻率高於0.01的位點；3）內含子區，非翻譯區位點；4）PolyPhen和CADD預測容忍的位點，PhastCONS與GERP認為處於非保守區的位點。

尋找睾丸特異高表達的基因

NOA相關基因列表

由作者在pubmed文獻檢索獲得NOA相關基因列表，共計57個，與阻塞性NOA、精子運動缺陷、少精症相關的基因被排除在外，具體包括1）位於Y染色體AZF區9個基因；2）NOA患者隊列中發現的13個候選致病基因；3）具有統計學差異的但是在正常人群中也有很少出現的29個候選關聯基因；4）大家系中連鎖與共分離發現的6個基因。

結果

通過上面提到的數據分析參數，只有12個基因（純合）在6個大家系中被鑒定出來。其中5個基因在睾丸組織中特異高表達。

在小鼠敲除模型資料庫中發現，5個基因中的4個(Ccdc155, Nanos2, Spo11, and Tex14)被敲除後影響小鼠精子生成。另外一個Wnk3，敲除後激活了Nkcc1，引起小鼠不育。在75個散發NOA患者中，有4例患者攜帶5個新發現基因中的3個，進一步支持了新基因與NOA的相關性。在隨後的分析中發現有6個散發患者攜帶57個已知致病基因的變異，而在74個正常對照中未發現。

結論

總之，對於所有在常規評估後仍保留特發性的NOA患者，在臨床檢查中引入WES可能有助於人類不孕的研究。當與數百個基因參與小鼠生殖異常的功能性證據相結合和人類睾丸特異性基因表達模式時，該策略可能提高診斷率和發現新型男性不育基因。

遊俠點評

近親家庭導致的遺傳病可提高發現新基因成功率，與表達數據結合和小鼠模型可進一步鎖定致病基因。62個NOA基因列表可為臨床檢測提供參考，1051個基因列表可為發現睾丸新基因提供參考。

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