基因編輯界重磅明星登場——CRISPR/Cas System
一圖搞清CRISPR作用原理
（以CRISPR/Cas9為例）
CRISPR其實是我的簡稱，我還有一個特別長的全稱——Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，當然我還有中文名字，但是不是很常見——規律成簇的間隔短迴文重複序列，可能是因為太長了吧，哈哈哈。
其實，不難看出，我是一段DNA序列，其中包括重複的repeat片段和將repeat間隔開的spacer片段，而想要發揮作用，還需要我的幾個小幫手：我的同卵雙胞胎哥哥tracrRNA(trans-activating CRISPR RNA)，以及我們的爸爸Cas9蛋白，為什麼Cas9是我們的爸爸呢，一會再做解釋。當然，也可以看出，其實我們家族都是在同一序列上表達的。
想要形成成熟的CRIPR/Cas System，需要經過以下幾個步驟：
1.Pre-crRNA(pre-CRISPR RNA)的形成。即DNA序列經過轉錄得到repeat和spacer間隔的RNA序列，以及tracrRNA和Cas9蛋白。
2.招募核糖核酸酶（RNase Ⅲ）進行剪切。轉錄得到的RNA序列招募RNase Ⅲ對其進行剪切，同時tracrRNA和crRNA進行互補配對，形成部分雙鏈的RNA結構，當這二兄弟聚集在一起後，有了一個新的名字——guide RNA(gRNA)，CRISPR System的識別功能就由其來完成。
3.任意鹼基的填補。crRNA形成spacer+ repeat的結構後，在其5』端會有任意鹼基加到序列上而成為成熟的crRNA，其中spacer作為一個中間連接序列。
4.識別和剪切外源DNA序列。當外源DNA序列出現時，gRNA會對其進行檢索，當發現protospacer adjacent motif(PAM)區域時，gRNA便立即與其互補配對進行結合，同時立即招募Cas9蛋白，使DNA雙鏈打開，對其PAM區及之前的一段序列進行切割，得到雙鏈DNA片段。
5. Cas家族蛋白是CRISPR/Cas System的核心蛋白質，其剪切作用以及剪切的不同對象是不同CRISPR/Cas System的重要區別特徵，因此Cas9蛋白是我們的爸爸了，當然我們的爸爸還有他的兄弟，比如dCas9、Cas12a(Cpf1)、Cas13(C2C2)等
以上就是我和我的家族成員作用機理，不知道你對我們家族的作用過程是不是有了一個基本的了解呢？接下來我要自述發展史咯！
同大家所熟知的限制性核酸內切酶一樣，CRISPR/Cas System也是生命進化歷史上，細菌同病毒戰鬥所誕生的一種免疫武器。當病毒入侵時，通過gRNA的識別和Cas家族蛋白的剪切，悄無聲息地把病毒基因從自己的染色體上清除，可以很好地保護細菌而消滅病毒。Cas9蛋白是最早被發現的Cas家族蛋白，其切割DNA的能力被寄予厚望。隨後，dCas9的成功問世再次給基因編輯領域帶來福音，dCas9同樣靶向DNA，但其作用結果僅是和DNA結合，而不切割，因此可以利用dCas9進行基因沉默、表達調控，讓其發揮類似DNA甲基化的作用。
在CRISPR領域，不得不提到兩位大牛——華人科學家、美國科學院院士、麻省理工學院的張鋒和加州大學伯克利分校的Doudna教授，二人在CRISPR領域都頗有建樹，撰寫了CRISPR/Cas System的開山文章、Cas12(Cpf1)的發現以及CRISPR的應用SHERLOCK、SHERLOCK V2、DETECTER等多篇重量級文章。同樣，還有哈佛大學的David Liu教授也參與到這場CRISPR「軍備競賽「當中，其利用Cas9系統開發出CAMERY工具，可以用來記錄細菌中發生的」點點滴滴「，作為細菌/細胞生命過程中的」黑匣子「。
CRISPR為遺傳學、基因分子生物學等基礎領域帶來了巨大驚喜，提高了基因編輯的效率，其應用更多的是作為一個編輯工具，在各種基因相關疾病的研究中用來插入、改寫、刪除鹼基以達到辨析基因功能的作用。同時，其靶向作用通過gRNA實現，因此只需要改變其中crRNA的序列，便可改變其「制導「方向，進行新的打靶；在細菌中，CRISPR/Cas System更多以質粒的形式存在，因此將其導入模式化生物、工程菌乃至真核細胞都較方便簡單。然而，CRISPR/Cas System也存在所有基因編輯工具都不可避免的脫靶問題，且其脫靶率並不低，因此降低其脫靶率、提高基因編輯的準確性也是未來的科研突破方向之一。其未來更廣闊的應用方向將會是面向更多基因疾病，研究其機理，同時開發出一系列可用於臨床的檢測、治療工具。
References
[1] Martin Jinek, Jennifer A. Doudna, etc. A Programmable Dual-RAN-guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity. Science. 17 August 2012(337): 816-821
[2] Bernd Zetsche, Feng Zhang, etc. Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System. Cell. 2015, 163: 759-771
[3] Janice S. Chen, Jennifer A. Doudna, etc. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 15 February 2018
[4] Jonathan S. Gootenberg, Feng Zhang, etc. Multiplexed and portable nucleic detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 15 February 2018
[6] CRISPR到底是一種怎樣的技術？https://www.zhihu.com/question/22356523
[7] CRISPR/Cas9：基因編輯的歷史與發展. Bioworld
[8] 專家指路：如何追上CRISPR技術快速發展的腳步？. 生物通http://www.ebiotrade.com/newsf/2017-3/201736135401511.htm
文字：楊炎霖
排版：馬懿琦
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