實驗做不出來，可能是"太乾淨」的錯：實驗動物的免疫缺陷或成軟肋

對於大部分實驗室來說，實驗動物（尤其是嚙齒類）都飼養於清潔無菌的環境中。但是一些免疫學家認為，在尋求標準化、無污染的小鼠的過程中，科學家們使這些實驗小鼠變得不再是人類免疫系統的可靠模型——適量帶點細菌能讓小鼠模型更好地用於人類疾病研究。

撰文 Cassandra Willyard

在 2 月一個異常溫暖的早晨， Mark Pierson 驅車 20 分鐘來到明尼阿波利斯的一家大型寵物店。作為明尼蘇達大學的一位免疫學家，Pierson 經常來這裡買小鼠，所以大部分員工都認識他。這次他要買十隻小鼠，店員把它們從玻璃盒子里捉了出來。Pierson 需要體型較小的小鼠，因為它們通常比較年幼——他的要求算不上嚴苛。這些小鼠可能都攜帶了他想要的東西：細菌。

來源：Gosia Herba

這些小鼠即將進入美國監控最嚴密的實驗室之一，該實驗室通常用於研究肺結核和基孔肯亞病毒等危險病原體。這些從寵物店購買的小鼠雖然可能不會造成嚴重的人類感染，但它們攜帶的病原體會對實驗室中數百個其它研究小鼠造成嚴重威脅。

它們很快就會有新室友，每一個都會與一群黑色的實驗室小鼠混養在一起，共享食物、水、小窩，以及最為重要的——病原體。此前，這些實驗小鼠一直被飼養在一個極其潔凈的環境中，沒有接觸過大多數的疾病病原，所以其中一些在和寵物店小鼠混養後會生病、死亡。活下來的實驗室小鼠將形成更類似於野生小鼠的強大免疫系統，同時可能也更接近人類的真實情況。

Pierson 的做法實際上並不符合實驗室的規矩。50 多年來，科學家一直在努力使實驗室小鼠變得更潔凈。在現在的大多數實驗室里，動物的籠子、水和食物都要經過消毒處理。明尼蘇達大學的免疫學家、Pierson 所在實驗室的負責人 David Masopust 指出，他們竭盡全力避免小鼠接觸到自然環境中的感染。這些努力卓有成效：隨著病原體等複雜因素得到控制，小鼠實驗的結果變得越來越穩定。

但是現在有大量的研究表明，這種潔凈度是有代價的——嚙齒動物無法建立健全的免疫系統。在尋求標準化、無污染的小鼠的過程中，科學家們使這些實驗小鼠變得不再是人類免疫系統的可靠模型，因為人類生活在充滿微生物的世界裡，這對於一些在小鼠模型上大獲成功的新療法和疫苗在臨床上的應用有重大影響。雖然目前沒有明確證據將臨床試驗的失敗歸因於實驗小鼠過度乾淨，但 Masopust 認為潔凈的人造環境一定有影響。一些基於動物實驗的療法在人體身上的轉化成功率不盡如人意，並非什麼秘密；根據一項研究的估計，90％ 進入臨床試驗的藥物會失敗。Masopust 說：「你不得不懷疑，過度潔凈的實驗環境可能對實驗產生了影響，令人被誤導。」

這就是為什麼 Masopust 等人正在開發帶菌模型，以便更好地模擬免疫系統在自然界中的建立過程。有些團隊會讓小鼠感染一些疾病，而另一些則將天然微生物菌群引入小鼠體內。但飼養這些帶菌小鼠可能會有風險。密蘇里大學的微生物組研究人員 Aaron Ericsson 指出，寵物店裡的小鼠攜帶大量病菌，就跟來自狄更斯所描述的孤兒院似的。實驗室動物管理者非常重視生物安全，而小鼠是一種寶貴的資源。研究人員最怕的就是這些小鼠造成大規模感染。

散布細菌

Masopust 在十多年前就開始考慮小鼠潔凈度帶來的問題。實驗小鼠的免疫組成與人體的免疫組成之間存在的巨大差異令他感到震驚。當時，許多研究人員認為這是因為遺傳學上的差異造成的，但 Masopust 懷疑，部分原因可能在於實驗小鼠的生活環境。他想知道這些問題是存在於所有小鼠中，還是僅存在於實驗小鼠中。

為了解答這個問題，Masopust 開始比較實驗室小鼠、寵物店小鼠以及穀倉里野生小鼠的免疫組成。在實驗室小鼠的血液中，抗癌和抗感染的記憶 T 細胞，即接觸過病原體的免疫細胞非常少。事實上，實驗室小鼠的身體其它組織中幾乎完全沒有 T 細胞，而這些記憶 T 細胞則廣泛存在於人類、野生小鼠和寵物店小鼠的各個組織中。總體而言，實驗室小鼠的免疫系統似乎非常「原始」，更接近人類嬰兒而非成人的免疫系統。

Masopust 懷疑感染史具有重要作用。因此，他認為可以通過將實驗室小鼠暴露於感染因子下來誘導其免疫系統發生變化。如果實驗室小鼠的問題在於過於潔凈，那麼或許可以試著讓它們變「臟」。

他設計了一個看似簡單的實驗：將一隻寵物店小鼠放入一個裝有幾隻實驗小鼠的籠子里。實驗小鼠會感染上寵物店小鼠攜帶的各種病原體——皮毛蟎、蟯蟲和小鼠肝炎，或許之後在免疫方面會更接近寵物店的小鼠。與 Masopust 合作的明尼蘇達大學免疫學家 Stephen Jameson 指出，這種混養方式「會讓傳統備受呵護的實驗室小鼠更貼近人類可能具有的正常免疫過程」。

然而研究人員遇到的一大難題是不知道該在哪裡養這些帶菌的小鼠。Masopust 說：「我最不想做的就是污染同事的小鼠。」當他第一次與動物飼養人員討論這一實驗時，大家都很緊張。但幸運的是，明尼蘇達大學當時正準備在 Masopust 的實驗樓里建造一個高度隔離的實驗室——專為生物安全三級（BSL-3）研究而設計，這意味著它能夠安全地隔離人類致病菌。同時，它也可以防止帶病小鼠將病原體傳播給其它小鼠。2013 年，Masopust 等人設法申請到了一個房間。Masopust 說：「我運氣好，BSL-3 動物房利用率不高。為了增加收入，實驗室允許其他人使用。」現在，這個房間里共有 500 只小鼠，全部養在塑料籠子里，每隻籠子里混養著幾隻潔凈的實驗室小鼠和一隻髒兮兮的寵物店小鼠。

在與寵物店小鼠混養一個月後，「變髒」的實驗小鼠開始表現出很多與野生小鼠和寵物店小鼠一樣的免疫特徵。它們比正常實驗小鼠具有更多的分化記憶 T 細胞，並且還發育出了組織駐留記憶 T 細胞。標準實驗小鼠的免疫相關基因活性與新生嬰兒差不多，而寵物店小鼠和與其混養的實驗小鼠的基因活性特徵則與成年人更接近。研究人員使用單核細胞增生李斯特氏菌感染這些帶菌的實驗小鼠，結果發現帶菌小鼠比乾淨的小鼠表現出更強的抵抗性：前者感染三天後攜帶的細菌數量下降超過四個數量級，這一結果與接種過相應疫苗的實驗小鼠相近。

Masopust 在 BSL-3 實驗室工作後不久，聖路易斯華盛頓大學的免疫學家 Herbert Virgin 等人獨立開展了一個類似的項目，以了解實驗室小鼠的免疫系統。但他們並沒有使用寵物店小鼠來誘發感染，而是決定自己誘發感染，這種方法比混養更容易控制變數。Tiffany Reese 是 Virgin 實驗室的一名成員，也是德克薩斯大學西南醫學中心的一名免疫學家，她說：「作為一名訓練有素的病毒學家，我想知道小鼠感染了什麼病原體。」

他們選擇了四種病原體：兩種皰疹病毒，一種流感病毒和一種能長期感染小鼠小腸的腸寄生蟲。這幾種病原體與發展中國家兒童經常感染的病原體相似。研究人員每次用一種病原體感染小鼠，並且讓小鼠在下次感染前充分恢復，以便模擬人類感染過程——感染、恢復、再感染。另一組小鼠用鹽水進行模擬接種。最後的免疫激發利用了黃熱病疫苗，該疫苗是一種減毒活疫苗。

與 Masopust 團隊一樣，Virgin 團隊注意到連續接受感染的小鼠發生了顯著的變化，但是兩支團隊的小鼠在基因表達以及對疫苗的反應方面存在不同：起初，它們的抗體應答是一樣的，但一個月後，通過混養感染的實驗小鼠的抗體水平較低。目前還不清楚這種差異是否影響疫苗的效果。Virgin 說：「我認為目前尚不能確定這一結果是否有某種現實意義。」儘管如此，他希望帶菌小鼠模型能夠幫助人們更好地理解免疫系統。

圖片來源YouTube

野性的呼喚

其他研究人員則從寵物店以外的方式尋找「臟」小鼠。美國馬里蘭州糖尿病、消化和腎臟疾病研究所（NIDDK）的免疫學家 Stephan Rosshart 驅車幾百公里去州內和哥倫比亞特區的各個馬廄捕捉野生小鼠。

Rosshart 於 2013 年加入了 NIDDK 免疫學家 Barbara Rehermann 的實驗室。二人仔細研讀微生物組相關文獻，發現微生物組對免疫系統有巨大的影響，但大多數論文都是基於兩種實驗小鼠的對比研究：一些攜帶來自實驗室的微生物組，另一些完全沒有微生物組。Rosshart 想知道如果他給實驗室小鼠添加野生鼠的微生物組會發生什麼，或許那將保留實驗室小鼠的遺傳背景，但卻使其生理更接近野生鼠。

Rosshart 對野生微生物組供體有特殊的要求：成年小鼠、與實驗室小鼠基因相似，沒有病原體從而不會污染美國國立衛生研究院（NIH）的其它小鼠。Rehermann 試圖說服 Stephan 這不是一個好思路，因為操作難度很高。但 Rosshart 仍堅持己見。每天早上，Rosshart 都會開車去 3 到 10 個穀倉，檢查 100 多個只捕鼠器，然後將抓到的小鼠帶回研究院。隨後，他會解剖這些小鼠，並且保存它們的組織和糞便。到了晚上，他沿原路線捕捉更多小鼠，並在捕鼠器中重新放置花生醬。因此，他每天從凌晨 4 點半開始工作，直到午夜才結束。他就這樣每周工作 7 天，持續了兩個月。Rosshart 說：「如果只做一個星期還是很有趣的，但時間越久，就變得越具有挑戰性。」

最終，Rosshart 一共處理了 800 多隻小鼠，他和同事們從中選出三隻遺傳背景適當且沒有病原體跡象的小鼠。他們將這幾隻小鼠糞便中的微生物轉移到懷孕的無菌小鼠身上。當後一種小鼠分娩時，它們會將微生物傳給幼崽。該團隊將這些小鼠與從已消毒的實驗室環境中獲得微生物組的無菌小鼠進行了比較。

接著，他們用小鼠適應流感病毒株感染這些小鼠；92％ 的攜帶野生微生物組的小鼠活下來了，而攜帶標準實驗室微生物組的小鼠只有 17％ 存活下來了。當研究人員將兩組小鼠暴露於可導致結腸癌的化學物質之下時，前一種小鼠的癌症病情也相對輕些。Rehermann 說：「一個大膽的假設是，如果實驗室小鼠更像自然環境中的小鼠，那麼這些小鼠也會更適用於研究生活在自然環境中的人類。」

然而，更「野生」並不總是會帶來更強的抗感染能力。上個月，普林斯頓大學的演化生態學家 Andrea Graham 和她的同事們證實，「野生化」的實驗室小鼠更易發生蠕蟲感染。Graham 讓實驗室小鼠在 8 個室外籠子里自由行動。當她釋放第一批時，小鼠立即開始探索周圍環境，挖洞並尋找新食物，有一些甚至徹夜活動。小鼠碰到的微生物顯著影響了它們應對某些寄生蟲的能力。Graham 實驗室的小鼠能夠很快清除寄生蟲感染。但「野生化」的小鼠「在幾周時間內都感染了大量蠕蟲」。研究人員仍在嘗試探索可能的原因，這或有助於揭示免疫系統如何在更自然的環境中工作。Rosshart 表示，免疫系統或許優先清除致命的微生物——病毒和細菌，然後再處理蠕蟲等非致命的感染。他補充說：「免疫反應不可能完美對抗一切。」

帶菌小鼠模型讓研究者們很興奮。紐約 Taconic Biosciences 公司的微生物組產品與服務負責人 Alexander Maue 表示，從多個角度來說，這些研究都具有里程碑意義。這些「臟」小鼠使得研究者「能夠探索在正常小鼠模型中無法發現的保護性免疫的不同機制。」

模型的廣泛應用

但研究人員還不知道哪些模型最適合用於研究哪些問題。例如，在 Masopust 的研究中，每組實驗小鼠獲得不同的病原體組合。Masopust 認為這樣做有利有弊，因為人類的病原體也是多樣化的。而在 Virgin 的設計中，小鼠則獲得了明確的一組病原體，但其對免疫系統的影響並沒有很明顯。

英國愛丁堡大學的免疫學家 Eleanor Riley 指出，這些模型都不能完全複製大自然中的真實情況。野生小鼠在許多方面與實驗室小鼠不同：飲食、性行為、日光或溫度都會產生影響。她說：「我認為我們需要更多地與生態學家和動物學家合作，共同研究現實環境，如果單純採取簡化的方法會存在一定風險。」

Virgin 表示，即使是在實驗室中重現一個簡化的野生環境也是令人頭痛的問題。他認為大家都意識到這麼做的重要性，但問題是這需要很多基礎設施。雖然野生微生物組模型解決了許多有關病原體接觸的問題，但正如 Rosshart 所知，捕獲野生小鼠是極其麻煩的事情。

帶菌小鼠模型是否比標準的實驗小鼠更能代表人類的狀況，進而為藥物開發提供更好的測試基礎，還有待進一步觀察。理想的實驗可能需要在新模型中測試一些之前在臨床試驗中失敗的療法，以查看其結果是否與人類試驗結果相同。

Masopust 的團隊正在與兩家製藥公司合作進行這方面的研究。他們選擇了一種在人體研究中失敗的療法，其中一家公司想知道帶菌小鼠是否可以預測這種失敗。另一家公司要求 Masopust 使用他的小鼠來測試在乾淨的小鼠身上效果顯著的候選療法。初步的數據表明該療法對帶菌小鼠沒有明顯效果。

其他實驗室也開始飼養「臟」小鼠。去年 12 月，西雅圖貝納羅亞研究所（Benaroya Research Institute）的免疫學家 Daniel Campbell 從 NIH 那獲得了一筆資助，用於構建帶菌小鼠模型。他和同事們想要測試他們為自身免疫病開發的治療方法。這類療法似乎對無菌小鼠非常有效，但他表示很多在無菌小鼠上有效的療法在轉化中都失敗了。Campbell 認為帶菌小鼠比標準實驗小鼠的免疫系統更發達，因此可能用做一種更接近真實狀況的模型來測試這些療法。例如，帶菌小鼠能夠幫助研究者可以更好地檢測到副作用，他說：「安全性是一個大問題。」

Campbell 表示構建混養小鼠模型非常具有挑戰性，但是它是值得的。他的許多同事都希望用「臟」小鼠去研究一些問題。他說：「我認為很多人都會有興趣，並且願意進行相關嘗試。」

本文轉載自「Nature自然科研」（ID:Nature-Research）

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